蔣 瑤，陳文波，陳其兵

(1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 凱里 556011； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130)

慈竹CBF1全長基因的克隆及其分析

蔣 瑤1，2，陳文波1，陳其兵2

(1.凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 凱里 556011； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130)

分離和克隆慈竹CBF1基因，探明低溫下轉(zhuǎn)基因煙草誘導(dǎo)的表達情況，以慈竹葉片為材料，通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆慈竹CBF1基因的全長cDNA序列，并進行生物信息學(xué)分析；同時選用轉(zhuǎn)基因煙草T2代株系為材料，進行半定量RT-PCR，分析NaCBF1基因在煙草中的表達情況。結(jié)果表明：克隆得到慈竹NaCBF1基因(GenBank登陸號為JN896707)，全長序列為1 051 bp，其中包括5′-UTR 54 bp，3′-UTR 334 bp，編碼區(qū)663 bp，編碼223個氨基酸，分子量為23.48 kDa，等電點為5.27，為不穩(wěn)定疏水性蛋白。氨基酸序列比對分析表明，NaCBF1與CtCBF1、HvCBF1和TaCBF1一致性分別為93%、86%和85%，且NaCBF1與CtCBF1、PeDREB1聚為一類。不同低溫脅迫下，轉(zhuǎn)NaCBF1基因煙草植株均能正常轉(zhuǎn)錄，表明具有耐寒性。NaCBF1參與植物對低溫脅迫的調(diào)控，對其環(huán)境脅迫響應(yīng)還有待探討，為進一步分析其在不同信號途徑相互作用中的功能和調(diào)控機制提供有力證據(jù)。

慈竹；CBF1；基因克?。换虮磉_

低溫是影響植物生長、發(fā)育的主要因子之一，經(jīng)低溫脅迫后會受到不同程度的傷害，主要包括低溫感受、低溫轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多個階段[1]，CBF是一類與植物逆境脅迫(如低溫、干旱及高鹽等)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，且逐漸成為植物抗寒研究的熱點之一[2]，其中CBF1轉(zhuǎn)錄因子是植物抗冷馴化過程中起關(guān)鍵作用的一個因子[3]，其結(jié)構(gòu)具有AP2結(jié)構(gòu)域，其基因與順式作用元件CRT/DRE結(jié)合，其上游含有ICE1基因，在逆境脅迫中起著重要調(diào)控作用[4]，并能誘導(dǎo)脅迫下游COR基因的表達，提高植物的非生物逆境脅迫能力[5]。近年來研究表明，已從番茄[6]、山葡萄[7]、草莓[8]、油棕[9]、茶樹[10]、二穗短柄草[11]、獼猴桃[12]等多種植物中分離出CBF類似基因，從而引起植物體內(nèi)的多種生理生化過程變化，能夠有效提高植物抗寒能力，這一機制可有效減少植株能量損失，從而保證植物生長發(fā)育正常。

CBF1轉(zhuǎn)錄因子不僅參與低溫下誘導(dǎo)的表達，還參與其他脅迫誘導(dǎo)的表達。低溫、干旱、高鹽和ABA條件下能誘導(dǎo)蘋果MdDREB1表達[13]。ABA和干旱脅迫下能瞬時誘導(dǎo)PdCBF1表達[14]。實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，不同處理(低溫、干旱、鹽及ABA等)均能誘導(dǎo)扁桃SG-AcCBF1基因的表達[15]。與野生植株相比，低溫處理擬南芥植株，發(fā)現(xiàn)AtCBF1基因的轉(zhuǎn)錄水平均高于常溫生長的植株，在1 h內(nèi)表達量有所提高，3 h達到最高峰，一直保持到12 h[16]。

慈竹(Neosinocalamusaffinis)是禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)植物，也是四川省廣泛分布和栽培的經(jīng)濟竹種之一，經(jīng)低溫脅迫后，發(fā)生倒伏、竹兜腐壞，影響竹漿造紙，為提高慈竹抗逆性、篩選抗性相關(guān)基因、了解抗逆機理勢在必行，但通過分子育種提高慈竹耐寒性研究甚少，因此，以慈竹葉片為試材，通過克隆慈竹NaCBF1全長基因，對其序列進行生物信息學(xué)分析，并檢測其基因在低溫下的誘導(dǎo)表達，以期為進一步開展CBF1基因功能和蛋白質(zhì)的特性研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

3年生健壯、無病害的慈竹枝條采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都竹園帶回實驗室，取其葉片(去葉脈)置于液氮罐中2 min，再放置于-80 ℃超低溫冰柜中。

1.2 方法

1.2.1 慈竹葉片組織中總RNA的提取 利用RNAprep pure 植物總RNA提取試劑盒提取慈竹葉片組織中總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性和紫外分光光度計檢測純度。

1.2.2NaCBF1基因序列的克隆 參照protoScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(NEB)提供的反應(yīng)條件合成cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20 ℃。

根據(jù)Genbank不同植物CBF1蛋白保守域設(shè)計簡并引物(NaCBF1-1F：5′-CCG AAG AAR CCN GCG GGN CGG AAG AAG T-3′，NaCBF1-1R：5′-AAG CGG AGT CGG CGA AGT TGA GGC ANG c -3′)，采用Touch-down PCR進行擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，以后每個循環(huán)的退火溫度降低1 ℃，共5個循環(huán)；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，以后每個循環(huán)的退火溫度降低1 ℃，共5個循環(huán)；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

根據(jù)保守區(qū)測序結(jié)果在5′端和3′端分別設(shè)計兩條引物(5′-Outer primer：5′-CCC GCC GTA TCT CGT CGT GT-3′，5′-Inner primer：5′-CGG CGA GTC GGC GAA GTT GA-3′； 3′ -Outer primer：5′- GGA CGT TGC TGC GAT CAG -3′，3′-Inner primer：5′- GGG GCG GAC CAA GTT CAA -3′)。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。①95 ℃變性30 s；②61 ℃退火30 s；③72 ℃延伸90 s；循環(huán)①～③，35個循環(huán)；④72 ℃延伸10 min。

將5′端和3′端測序結(jié)果與保守區(qū)片段拼接得到全長序列，根據(jù)拼接序列設(shè)計編碼區(qū)全長cDNA序列的特異引物(NaCBF1-2F：5′- ATG GAC GTT GCT GCG ATC AGC AGC-3′，NaCBF1-2R：5′- TCA GTA GCT CCA TAG CCT GAC CTC-3′)，以慈竹葉片組織中cDNA為模板，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物目采用膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物用pGM-T vector 16 ℃連接轉(zhuǎn)化大腸埃希菌E.coilTop10，篩選出陽性克隆送華大基因測序，測序結(jié)果利用DNAMAN、Mega5.0和ClustalX進行序列分析。

1.2.3NaCBF1基因的生物信息學(xué)分析 利用ExPaSy ProtScale軟件和SOPMA軟件分別進行親/疏水性和α-螺旋(α-helix，H)、β-轉(zhuǎn)角(β-turn，T)、無規(guī)卷曲(random coil，C)以及延伸連(extended strand，E)進行分析，同時利用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)樹，采用Swiss-Model程序進行同源模建[17]。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草T2代半定量PCR 對T2代植株(轉(zhuǎn)基因型和野生型)進行不同溫度(15、4、0和-2 ℃)處理，分別提取轉(zhuǎn)基因陽性株系和野生型株系葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-PCR，煙草β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果與分析

2.1NaCBF1基因編碼區(qū)全長cDNA的克隆和序列分析

以慈竹葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，采用簡并引物(NaCBF1-1F和NaCBF1-1R)進行RT-PCR擴增，經(jīng)切膠回收、連接轉(zhuǎn)化和測序，證實保守區(qū)片段長度為480 bp圖1a，與預(yù)測目的片段大小基本一致。

根據(jù)保守區(qū)片段，采用RACE技術(shù)，分別設(shè)計5′端和3′端引物，PCR擴增得到5′端373 bp，3′端897 bp的片段，將3段核苷酸序列進行拼接，得到一個長為1 051 bp的預(yù)測片段。再將其拼接的序列設(shè)計一對特異引物NaCBF1-2F和NaCBF1-2R，通過RT-PCR擴增得到編碼區(qū)650 bp的cDNA片段(圖1b)。經(jīng)測序后進行BLAST同源性分析，確認(rèn)得到1條cDNA序列，命名為NaCBF1，GenBank登錄號為JN896707。

圖1 慈竹NaCBF1基因保守片段PCR產(chǎn)物(a)和編碼區(qū)全長PCR產(chǎn)物(b)Fig.1 PCR products of conservative domain and coding region fragment of NaCBF1 gene注：M. DL2000分子標(biāo)記；1、2：PCR產(chǎn)物(a)，1-3：PCR產(chǎn)物(b)。Note:M. DL2000 marker; 1,2 PCR products; 1-3 PCR products

利用DNAMAN軟件分析NaCBF1基因，該cDNA片段長1 051 bp，其中包含5′端非編碼區(qū)54 bp，663 bp ORF，3′端非編碼區(qū)334 bp，末端還有poly(A)16結(jié)構(gòu)。通過生物信息學(xué)軟件分析可得，ORF編碼221個氨基酸，分子量為23.48 kDa，等電點為5.27，其中主要氨基酸Ala含量為11.9%，Pro含量為8.5%，推測其為不穩(wěn)定疏水性蛋白。

進一步分析表明，NaCBF1編碼的氨基酸序列中存在一個保守的AP2結(jié)構(gòu)域和兩段段特征序列DSPRR和LWSY(圖2)的特異氨基酸，且在AP2保守區(qū)與其他植物高度同源。此外，作為AP2結(jié)構(gòu)域功能性保守氨基酸第14位的纈氨酸(14V)和第19位的谷氨酸(19E)仍存在NaCBF1中保守，這些都符合CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的特征。

圖2 NaCBF1cDNA的核苷酸序列(上排)和推導(dǎo)氨基酸序列(下排)Fig.2 Schematic representation of the nucleotide sequences(upper lines) and its deduced amino acid sequences(lower lines) of NaCBF1 cDNA注：小寫部分為非編碼區(qū)，ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，下劃線為核定位序列(NLS)，雙下劃線為AP2結(jié)構(gòu)域，方框為特征基序。Note:The lower-case characters indicate noncoding regions,indicates the start codon,indicates the stop codon,underline indicate the basic nuclear localization signals (NLS),double underline indicate AP2 domain,box indicate the characteristic sequence

用ProtScale的Kyte 和Doolittle算法對NaCBF1基因編碼氨基酸序列的疏水性/親水性進行預(yù)測。結(jié)果表明，NaCBF1基因編碼氨基酸序列偏向于親水性，大約在23-24區(qū)域具有很強的親水性，59-60區(qū)域具有較強的疏水性。用SOPMA預(yù)測NaCBF1基因編碼氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)包含38.75%的α-螺旋、14.37%的延伸鏈、5.62%的β-轉(zhuǎn)角和41.25%的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，且α-螺旋和無規(guī)則卷曲成為最大量的結(jié)構(gòu)元件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈則散布于整個蛋白質(zhì)中，說明是AP2結(jié)構(gòu)域的特征。

通過Blast比對分析，可知NaCBF1與CtCBF1(筇竹)[18]、HvCBF1(大麥)[19]和TaCBF1(小麥)[20]同源性較高，且一致性分別為93%、86%和85%，由此表明NaCBF1與CtCBF1的親緣關(guān)系最近。經(jīng)Swiss-model同源建模NaCBF1蛋白，發(fā)現(xiàn)含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊片3種結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋可能與其它轉(zhuǎn)錄因子或DNA相互作用有關(guān)，而β-折疊可識別順式作用元件，由此可看到其蛋白折疊空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象的變化。

通過Mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)(圖3)，NaCBF1與CtCBF1、PeDREB1(毛竹)[21]聚為一類，說明其親緣關(guān)系相近，但利用氨基酸序列比對說明(圖4)，PeDREB1與NaCBF1、CtCBF1核定位信號區(qū)域PKRRAGRTKFKETRHP存在較大差異，以及羧基末端保守基序LWSY存在由W變成L 的1個氨基酸變異，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活的差異，NaCBF1與CtCBF1保守區(qū)域存在少部分氨基酸的差異，由此推測不同竹種間的基因結(jié)構(gòu)域的差異，從而導(dǎo)致不同竹種間的抗寒性也存在不同。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree

圖4 NaCBF1與其他部分植物的CBF1氨基酸序列比對Fig.4 Multiple amino acid sequence alignment of CBF1 from Neosinocalamus affinis and other plant species

圖5 不同溫度脅迫下CBF1過表達轉(zhuǎn)基因煙草的半定量RT-PCR鑒定Fig.5 Semiquantitative RT-PCR analysis of overexpression NaCBF1 gene in transgenic tobacco leaves under different temperature stresses

2.2 不同溫度脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因煙草的半定量RT-PCR分析

分別提取不同溫度處理下PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草株系(OE1 、OE2和OE3)和野生型煙草WT株系葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行RT-PCR，內(nèi)參為煙草β-actin。在不同溫度處理下，過表達轉(zhuǎn)基因煙草OE1、OE2和OE3株系中均擴增出NaCBF1基因特異性條帶和β-actin內(nèi)參基因條帶，而野生型煙草WT中只有β-actin內(nèi)參基因條帶(圖5)。由此表明，NaCBF1基因在轉(zhuǎn)基因煙草植株中能夠正常轉(zhuǎn)錄，且具有一定的耐寒性。

3 討論

對于竹亞科植物而言，溫度信號是調(diào)控植物冷馴化的因子，也是保證植物順利過冬的因素。CBF1基因功能以及在抗寒機理所起的作用在許多文獻中已有相關(guān)報道[22]，CBF1蛋白的AP2結(jié)合域第14位的纈氨酸(14V)和第19位的谷氨酸(19E)可能決定著CBF/DREB蛋白的DNA結(jié)合特性，本研究NaCBF1蛋白中也存在14V和19E氨基酸的保守性，可能決定NaCBF1蛋白對順式作用元件ACCGAC和GCCGAT(CRT元件的核心序列)具有相同的結(jié)合活性。CBF1轉(zhuǎn)錄因子一般含有PKK/RAGRxKFxETRH序列[23]，位于AP2 DNA結(jié)合域的上游，可能與蛋白質(zhì)運輸有關(guān)[24]，而DSAWR序列多位于AP2 DNA結(jié)合域的下游，這兩段短多肽序列均是特征基序，在進化程度不同的物種中保守存在。本研究表明，NaCBF1蛋白與CBF1蛋白AP2 DNA結(jié)合域上游序列一致，而下游序列為DSPRR，存在有2個氨基酸(P和R)的變異，可能正是由于 CBF蛋白這種既有較高的保守區(qū)，又有較高可變區(qū)的特點，保證了CBF轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的專一性及在激活功能上的多樣性，為后續(xù)的功能驗證以及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

序列比對表明，NaCBF1與筇竹、大麥和小麥等單子葉植物具有較高的同源性，都具有AP2保守功能域，同源性在 85%及以上，該區(qū)域與DNA 結(jié)合至關(guān)重要[25]，進一步說明NaCBF1可能是CBF1在慈竹中的同源基因。通過對NaCBF1蛋白三級結(jié)構(gòu)分析表明，含有1個α-螺旋和3個β-折疊，符合CBF轉(zhuǎn)錄因子的特征結(jié)構(gòu)[26-27]。

研究表明，經(jīng)過低溫脅迫后CBF的表達量會迅速增高[17]。受低溫脅迫的梁山慈竹再生植株隨溫度的降低其表達量升高[28]。低溫脅迫后的桑樹苗幼葉，能檢測到桑樹CBF1基因表達，隨后其轉(zhuǎn)錄水平迅速增加，在脅迫3 d后其表達量最高[14]。這些結(jié)果都說明，可能由于不同的逆境脅迫或逆境調(diào)控機制導(dǎo)致了CBF基因表達的差異。將NaCBF1轉(zhuǎn)入模式植物中，結(jié)果表明，其基因表達量高于對照，與張俊環(huán)[30]、周偉[31]等研究結(jié)果一致。該基因受低溫脅迫的誘導(dǎo)，為其是低溫脅迫轉(zhuǎn)錄因子提供了證據(jù)，推測在慈竹可能存在CBF1抗寒機制，可能參與了慈竹在逆境中的調(diào)控，但對于NaCBF1基因的功能及調(diào)控作用還有待于進一步的研究。以期通過模式植物的功能分析來進一步了解其是如何通過轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)控下游功能基因的響應(yīng)。已有研究表明，CBF/DREB可響應(yīng)多種非生物脅迫，不同植物由于氨基酸組成的差異是否改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，進而影響植物對不同環(huán)境脅迫的響應(yīng)機制。同時，基因的轉(zhuǎn)錄還取決于基因的啟動子序列，需進一步分離NaCBF1啟動子序列，對啟動子序列進行結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，以期獲得關(guān)于NaCBF1基因表達調(diào)控的更多信息。

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Molecular Cloning and Expression Analysis ofCBF1 Gene inNeosinocalamusaffinis

JIANG Yao1,2，CHEN Wen-bo1，CHEN Qi-bing2

(1.College of Environment and Life Science,Kaili University,Kaili 556011,Guizhou,China;2.College of Landscape Architecture,Sichuan Agriculture University,Chengdu 611130,Sichuan,China)

The aim of this study was to isolate ofCBF1 gene fromNeosinocalamusaffinisand analyze its expression patterns in the transgenic tobacco under low temperature stresses. In this experiment，the leaves ofNeosinocalamusaffiniswas used as material,the full length cDNA sequence ofNeosinocalamusaffinisCBF1 transcription factor gene was cloned by using RT-PCR and RACE techniques．The expression ofNaCBF1 gene in the T2lines of trangentic tobacco was analyzed by using semi-quantitative RT-PCR. The results showed that the gene was designated asNaCBF1 that GenBank accession number was JN896707. This gene was 1051 bp DNA fragment in full length，including a 5′-UTR (untranslated region) of 54 bp,a 3′-UTR of 334 bp and opening reading-frame (ORF) was 663 bp，encoding 221 amino acids with a conservative DNA binding domain. Its relative molecular mass was approximately 23.48kDa and isoelectric point was 5.27. After alignment of amino acid,the sequence ofNaCBF1 gene was respectively 93%,86% and 85% identical toCBF1 gene ofChimonobambusatumidissinoda,HordeumvulgareandTriticumaestivum.NaCBF1,CtCBF1andPeDREB1 were clustered into one group. The transcript level was increased in response to cold stress. It confirmed thatNaCBF1was related to the stress response, andNaCBF1 was related to the environmental stress. It was the basis for the research of gene structure and biological function,and for the analysis of the function of interaction in different signal pathway and regulating mechanism.

Neosinocalamusaffinis; CRT-binding factor1; Gene clone; Gene expression

2016-09-28

貴州省科技廳博士基金項目(黔科合J字〔2014〕2153號)；凱里學(xué)院博士啟動基金項目(BS201332)

蔣瑤，博士，副教授，從事生物技術(shù)等研究。E-mail:jiangyao0221@163.com