李紅英++覃大吉++陳菲菲++楊永康++李亞杰

摘要：以白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）的腋芽為外植體，以不同的光照時(shí)間、光照度和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA不同濃度配比以及MS、1/2 MS、1/4 MS培養(yǎng)基分別進(jìn)行初代培養(yǎng)、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、愈傷組織增殖培養(yǎng)、愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、叢生芽生根培養(yǎng)，并煉苗移栽。結(jié)果表明，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的愈傷組織形成率為97.2%；愈傷組織增殖培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的愈傷組織增殖能力為9.5倍；愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基1/2 MS+1.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA的愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)倍數(shù)為4.5倍；生根培養(yǎng)基1/4 MS+0.75 mg/L NAA的生根率為96.7%，生根平均數(shù)為8.2條/芽，煉苗移栽的成活率在91.5%～93.0%。通過(guò)該方法進(jìn)行白術(shù)種苗繁殖，有利于向國(guó)家作物種質(zhì)資源庫(kù)輸送優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源材料，豐富白術(shù)基因庫(kù)，便于白術(shù)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的交流與共享，從而提高育種水平與藥材生產(chǎn)能力。

關(guān)鍵詞：白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）；腋芽；愈傷組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949.778.4-61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）16-3110-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.028

Research on Fast Asexual Propagation Technology of Atractylodes Seedling

LI Hong-ying1，2，3，QIN Da-ji1，2，CHEN Fei-fei1，2，YANG Yong-kang2，LI Ya-jie1

（1. West Comprehensive Experiment Station of Hubei Provincial Agriculture Science and Technology Innovation Center， Enshi 445000， Hubei， China； 2. Enshi Qingjiang Bio-Engineering Co.，Ltd.， Enshi 445000， Hubei， China； 3. College of Food Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： Large-headed atractylodes（Atractylodes macrocephala Koidz.） axillary bud is used as explant， which is treated with different time and intensity of illumination， different concentration of 6-BA and NAA on MS， 1/2 MS，1/4 MS culture medium for original culture， callus induction culture， cultivating callus proliferation， induction of callus growing cultivation， multiple shoot clumps， rooting and seedling transplanting to find out the optimum fast asexual propagation technology. When callus induction media is 1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA， the callus formation rate is 97.2%. When callus proliferation medium is MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA， callus proliferation ratio is 9.5 times. When induction of callus growing medium is 1/2 MS+1.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA. When rooting medium is 1/4 MS+0.75 mg/L NAA， the rooting rate is 96.7%； the rooting ratio is 8.2 times； and seedling transplanting survival rate is 91.5%～93.0%. Atractylodes seedling breeding is beneficial to transfer high quality germplasm resources to the national crop germplasm bank， rich the atractylodes seed gene pool and facilitate atractylodes quality germplasm resource exchange and sharing， improve the level of breeding and medicinal material production level.

Key words： atractylodes（Atractylodes macrocephala Koidz.）； axillary bud； callus culture； rapid propagationendprint

白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.）為菊科（Compositae）蒼術(shù)屬（Atractylodes DC.）多年生草本植物，又名于術(shù)、浙術(shù)、冬術(shù)等，為中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎等功效[1]。近年來(lái)研究表明，白術(shù)有利尿、抗腫瘤、抗菌消炎、抗糖尿病、抗衰老等作用[2-4]。而且還含有許多具有藥理活性的化合物[5]。由于白術(shù)用途廣泛，市場(chǎng)需求量大，全國(guó)各地皆有種植。但白術(shù)生產(chǎn)中存在品種退化、類(lèi)型混雜、藥材質(zhì)量和產(chǎn)量均下降、有效成分含量不穩(wěn)定等問(wèn)題，市場(chǎng)需求無(wú)法得到滿(mǎn)足。為了改善這一現(xiàn)狀，課題組采用咸豐縣生產(chǎn)上表現(xiàn)好的白術(shù)田間類(lèi)型Ⅱ[6]，經(jīng)過(guò)4～5代的選優(yōu)得到的植株腋芽，通過(guò)組織培養(yǎng)快速繁殖和提純復(fù)壯，選擇遺傳性狀穩(wěn)定、繁殖系數(shù)顯著提高、成本顯著降低、藥材質(zhì)量和產(chǎn)量較高的優(yōu)系，從而豐富白術(shù)基因庫(kù)，促進(jìn)白術(shù)藥用次生代謝產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)[7-9]。通過(guò)以白術(shù)腋芽為外植體進(jìn)行快速繁殖，進(jìn)一步提高藥用植物的育種水平與藥材生產(chǎn)能力。為中藥材生產(chǎn)上快速示范推廣提供批量的優(yōu)質(zhì)種苗。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料來(lái)源于咸豐縣白術(shù)品種選育基地，在2015年4月，選取生產(chǎn)上表現(xiàn)良好的類(lèi)型、經(jīng)培育4～5代的二年生白術(shù)種苗。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有6-BA、NAA。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 初代培養(yǎng) 選擇優(yōu)良單株健壯、幼嫩的腋芽，修剪多余的葉片，先用清水沖洗1 h以上；在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行外植體的表面滅菌，先使用75%的酒精浸泡50 s，后使用去離子水沖洗4～5次，然后用0.1%的氯化汞溶液浸泡60 s，再用去離子水沖洗3～4次，最后用5%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min，期間不斷攪拌，再去離子水沖洗4次，倒出多余的去離子水，將腋芽放置培養(yǎng)皿中，待用。剪去無(wú)菌處理過(guò)的白術(shù)腋芽受傷的部位，將其接種于1/2 MS、pH 5.8～6.0初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境光照時(shí)間10～20 h/d、光照度1 500～2 000 lx。接種6～7 d后觀察腋芽生長(zhǎng)情況。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 培養(yǎng)20 d待苗長(zhǎng)到3～5 cm左右后，于超凈工作臺(tái)上將初代培養(yǎng)苗從培養(yǎng)瓶中取出，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用高壓滅菌后的醫(yī)用鑷子、醫(yī)用剪刀修剪腋芽后轉(zhuǎn)接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+ 0.5～1.0 mg/L 6-BA+0.1～0.5 mg/L NAA，培養(yǎng)環(huán)境光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，接種30 d后統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)基篩選 在超凈工作臺(tái)上將誘導(dǎo)出的愈傷組織用滅菌鑷子拿出，放到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用剪刀除去表面的培養(yǎng)基，接種到增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)基為MS+0.5～1.5 mg/L 6-BA+0.5～1.5 mg/L NAA，培養(yǎng)環(huán)境光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，接種45 d后統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.4 愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選 在超凈工作臺(tái)上，將培養(yǎng)到2～4 cm的愈傷組織用滅菌鑷子拿出，放到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用剪刀切成直徑0.3 cm的小塊，按5塊/瓶接種于愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5～2.0 mg/L 6-BA+0.1～0.5 mg/L NAA，pH 5.8～6.0，培養(yǎng)環(huán)境光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，選擇最佳培養(yǎng)愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.5 叢生芽生根培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上，將培養(yǎng)后長(zhǎng)到2 cm左右的白術(shù)叢生芽剪切，按3芽/瓶“品字形”排列轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為1/4 MS+0.1～1.0 mg/L NAA，培養(yǎng)環(huán)境光照時(shí)間10～20 h/d，光照度1 500～2 000 lx，培養(yǎng)30 d后觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.3 煉苗移栽

當(dāng)白術(shù)組培苗根長(zhǎng)長(zhǎng)到2 cm左右時(shí)，將培養(yǎng)瓶從組培室移出，置于煉苗室常溫閉瓶煉苗3 d，然后旋松蓋子2 d、全開(kāi)蓋2 d；煉苗完成后，將白術(shù)苗從培養(yǎng)瓶中移出，放入清水盆中，小心洗去根部瓊脂，然后撈出，移栽至基質(zhì)為泥炭土的苗圃中，澆透水，每天早晚清水噴灑葉面保濕，5 d后減少?lài)娝螖?shù)；然后每5 d澆灌1次低濃度營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液為1/2 MS大量元素、微量元素、鐵鹽等，15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)腋芽愈傷組織誘導(dǎo)與增殖

白術(shù)腋芽愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1，愈傷組織增殖培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2。在試驗(yàn)過(guò)程中，腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)7～15 d后，觀察到腋芽開(kāi)始有愈傷組織形成；腋芽愈傷組織增殖培養(yǎng)5～7 d后，觀察到白術(shù)愈傷組織開(kāi)始生長(zhǎng)，每個(gè)培養(yǎng)周期45 d。由表1、表2可知，白術(shù)腋芽愈傷組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)率與增殖倍數(shù)受植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA的影響較為明顯，愈傷組織直徑平均增殖5.2～9.5倍，其中1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA、MS+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA分別為白術(shù)腋芽愈傷組織誘導(dǎo)與增殖較為理想的培養(yǎng)基。

2.2 白術(shù)愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)

白術(shù)腋芽愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表3。試驗(yàn)觀察到誘導(dǎo)培養(yǎng)6～10 d后，白術(shù)愈傷組織芽開(kāi)始生長(zhǎng)，20 d后平均生芽數(shù)為3～4個(gè)/塊、15～20個(gè)/瓶。從表3可知，隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA濃度的增大，誘導(dǎo)率也隨之增大，但到一定范圍后隨著植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的增大，誘導(dǎo)率又降低。因此，1/2 MS+1.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為白術(shù)腋芽愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)較為理想的培養(yǎng)基。

2.3 白術(shù)苗生根與移栽

將培養(yǎng)后芽長(zhǎng)到2 cm左右的白術(shù)叢生芽剪切，按3芽/瓶“品字形”排列轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表4。試驗(yàn)觀察到，生根培養(yǎng)8～14 d后有根和芽生長(zhǎng)；從表4可見(jiàn)，培養(yǎng)30 d后，平均生根數(shù)為 4～5條/芽、12～15條/瓶。說(shuō)明NAA能促進(jìn)白術(shù)試管苗的生根，但是濃度高低差異明顯，生根效果以0.75 mg/L NAA較佳；濃度若再高，根容易產(chǎn)生畸形，而過(guò)低則生根率偏低，生根較為理想的培養(yǎng)基為1/4 MS+0.75 mg/L NAA。在煉苗移栽后15 d，統(tǒng)計(jì)成活率為91.5%～93.0%。endprint

3 討論

1）白術(shù)腋芽為優(yōu)異的外植體，通過(guò)無(wú)性繁殖，生長(zhǎng)速度快，可以保持母體遺傳的穩(wěn)定性，使遺傳過(guò)程得以控制，獲得優(yōu)良后代，并得以保存。

2）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA能共同快速促進(jìn)白術(shù)愈傷組織形成與增殖培養(yǎng)，一個(gè)周期能增加上千倍的植株，繁殖速度快、污染少，同時(shí)大大縮短了植物生長(zhǎng)周期，擴(kuò)大了群體數(shù)量，有利于對(duì)育種過(guò)程中出現(xiàn)的優(yōu)異中間材料進(jìn)行保存與評(píng)價(jià)，并加以利用。

3）白術(shù)愈傷組織叢生芽誘導(dǎo)率最高達(dá)95.9%，成活率91.5%～93.0%，并沒(méi)有產(chǎn)生變異，克服了種子繁殖后代性狀嚴(yán)重分離的現(xiàn)象，縮短了白術(shù)品種選育年限。

4）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑NAA能促進(jìn)白術(shù)試管苗根的生長(zhǎng)，大約在移栽8 d后生根，并且根系生長(zhǎng)發(fā)達(dá)旺盛；不過(guò)在濃度過(guò)低時(shí)生長(zhǎng)緩慢，過(guò)高則有部分網(wǎng)狀根出現(xiàn)，影響了試管苗的生長(zhǎng)質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.95-96.

[2] 段 啟，許冬謹(jǐn)，劉傳祥，等.白術(shù)的研究進(jìn)展[J].中草藥，2008， 39（5）：附4-附6.

[3] 陶元景，高山林，黃和平，等.白術(shù)莖尖組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)優(yōu)化研究[J].藥物生物技術(shù)，2010，17（6）：508-512.

[4] 胡長(zhǎng)玉，葉玉娟，郝祥霞，等.祁術(shù)的組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)研究[J].黃山學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，8（5）：57-60.

[5] 唐 寧，田福源，高山林.白術(shù)同源四倍體農(nóng)藝性狀和抗氧化酶活性的研究[J].藥物生物技術(shù)，2006，13（6）：442-445.

[6] 楊永康，陳行康，殷紅清，等.咸豐白術(shù)栽培類(lèi)型鑒定及育種研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，28（4）：405-409， 428.

[7] 肖 忠，宋廷杰，鄧才富，等.白術(shù)栽培試驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24（4）：14-16.

[8] 彭 菲，周日寶，張喜利.白術(shù)側(cè)芽離體誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（4）：26-28.

[9] 朱玉球，夏國(guó)華，方慧剛，等.白術(shù)組培快繁技術(shù)[J].中藥材， 2006，29（3）：212-213.endprint