國宏偉

山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)寧 272011

HPLC法測定肝康寧顆粒中綠原酸的含量

國宏偉

山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東濟(jì)寧 272011

目的 建立肝康寧顆粒中綠原酸含量的合理有效穩(wěn)定的測定方法。方法 采用高效液相色譜法測定綠原酸的含量。色譜柱:ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相：乙腈-2%醋酸溶液（13:87）。流速：1 mL/min,測定波長 327 nm。結(jié)果 綠原酸在0.32～1.93 μg范圍線性相關(guān)良好，相關(guān)系數(shù)(r=0.999 8)，回歸方程為Y=1 025 887X-65 235,平均回收率99.06%(RSD=1.10%,n=6)。精密度RSD=0.61%(n=6),重復(fù)性RSD=0.56%(n=6)。 結(jié)論 方法穩(wěn)定、可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

肝康寧顆粒；綠原酸；HPLC法；含量

近年來,肝病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì),其發(fā)病機(jī)制有些尚未明確?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為可能與多種因素有關(guān),如脂質(zhì)代謝異常、激素水平改變、環(huán)境與遺傳因素等原因,引發(fā)肝臟病變所致。肝病的病變?yōu)榭赡嫘圆∽冊(cè)谠缙谠\斷和合理治療下可康復(fù)。如不及時(shí)治療,部分肝病患者可能發(fā)展為肝纖維化,甚至肝硬化[1]。

肝康寧顆粒系中藥制劑，功能為清肝利濕,用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見周身，小便俱黃，體疲乏力，納呆，惡心厭油，苔黃膩，脈弦滑數(shù)；及急慢性肝炎，遷延性肝炎及慢性膽囊炎等。經(jīng)國家認(rèn)定列為全國中醫(yī)院急診科（室）必備中成藥，該藥已被國家列為中藥保護(hù)品種[2]。

肝康寧顆粒由柴胡、田基黃、茵陳、蒲公英、甘草、金錢草等組成[3]。原標(biāo)準(zhǔn)僅有茵陳藥材的薄層鑒別，難以控制藥品質(zhì)量，因此用高效液相色譜法測定了綠原酸的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)研究，提高了該品質(zhì)量的可控性[4]。選擇茵陳中主要成分綠原酸，進(jìn)行了含量測定。該試驗(yàn)采用高效液相色譜法。

1 儀器與試劑

Waters515 泵(美國)，2487 紫外檢測器（美國）。工作站：CEMO.甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。藥品為中試品（批號(hào)分別為20041201、20041203和20041206）。綠原酸（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，110753-200413）。

1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品12.00 mg,置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液5 mL,置25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（0.048 0 mg/mL）[5]。

1.2 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的該品，研細(xì)，取2 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL,稱定重量，超聲處理（功率 250 W,頻率 50 kHz）50 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[6]。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：精密稱取綠原酸對(duì)照品10.05 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL，分別置 25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS C18 柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）。 流動(dòng)相:乙腈-2%醋酸溶液（13：87）。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不得低于2 500[7-8]。

2.2 檢測波長的確定

取綠原酸對(duì)照品溶液，在200～500 nm光譜掃描，其最大吸收波長在327 nm,因此選用檢測波長為327 nm。

2.3 供試液制備方法考察

2.3.1 提取溶劑的選擇 分別采用甲醇、50%甲醇和95%甲醇為溶劑，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz）50 min。見表1。

表1 提取溶劑的選擇

結(jié)果表明，以50%甲醇為提取溶劑，綠原酸提取率最高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.3.2 提取方式的選擇 以50%甲醇為溶劑，分別采用下列提取方式提取50 min。見表2。

表2 提取方式的選擇

結(jié)果表明:兩種提取方式無明顯差異，考慮到超聲提取易于操作，故選擇超聲提取作為含量測定的提取方式。

2.3.3 提取時(shí)間的選擇 以50%甲醇作為提取溶劑，對(duì)下列超聲提取時(shí)間（功率250 W,頻率40 kHz）進(jìn)行了考察。見表3。

表3 提取時(shí)間的選擇

結(jié)果表明，提取50 min與提取70 min無明顯差異，其提取率均比提取30 min高，為節(jié)約時(shí)間，提高效率，選擇超聲提取50 min。

2.4 綠原酸線性關(guān)系考察

照高效液相色譜法（中國藥典2005年版一部附錄VID）試驗(yàn)，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μL依次注入高效液相色譜儀，測定峰面積。見表4。

表4 綠原酸線性關(guān)系考察

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以綠原酸進(jìn)樣量（μg）對(duì)綠原酸峰面積值進(jìn)行線性回歸，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=1 025 887X-65 235,相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。結(jié)果表明：綠原酸進(jìn)樣量在0.32～1.93 μg范圍內(nèi)與峰面積稱線性關(guān)系。見圖1。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性及空白試驗(yàn)

稱取茵陳陰性樣品2 g，同上操作，制成空白對(duì)照溶液。按上述儀器和試驗(yàn)條件，精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，分別進(jìn)行測定。從色譜圖可見，供試品溶液色譜中在與對(duì)照品溶液色譜中綠原酸峰相應(yīng)位置處顯相同的峰，且與其它峰完全分開；而空白對(duì)照溶液色譜中在與對(duì)照品溶液色譜綠原酸峰相應(yīng)位置處均未出現(xiàn)相同的峰。所以，空白對(duì)照溶液不干擾樣品中綠原酸的測定。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣測定，測定6次。結(jié)果表明，該法精密度良好。見表5。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20 μL，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣測定一次，共測定8 h。結(jié)果表明，供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表6。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按前文所述“含量測定”方法，對(duì)同一批樣品（20041201）分別制備6份供試品溶液，各吸取20 μL注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明，該法重復(fù)性良好。見表7。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取綠原酸對(duì)照品60.00 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為已知量的對(duì)照品（1.200 mg/mL）。 稱取批號(hào)為（20041201）的樣品 6 份，每份約0.1 g，按法配成供試品，分別精密加入上述對(duì)招聘1 mL,按供試品溶液項(xiàng)下測定，得如下結(jié)果。結(jié)果表明，回收率在95%～105%之間，加樣回收良好。見表8。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表8 綠原酸回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品的測定及最低限量的確定

按上述測定方法，對(duì)10批中試樣品進(jìn)行了綠原酸的含量測定。見表9。

表9 樣品的測定結(jié)果

參考不同產(chǎn)地茵陳藥材中綠原酸的最低含量0.41%，并根據(jù)成品中綠原酸轉(zhuǎn)移率為36.29%及上述10批中試樣品的測定結(jié)果，暫定該品每袋含綠原酸(C16H1809)計(jì)不少于6.0 mg。

3 討論

曾對(duì)下述流動(dòng)相進(jìn)行了使用摸索，乙腈-2%磷酸溶液（9：91），乙腈-2%醋酸溶液（13：87），結(jié)果以乙腈-2%醋酸溶液（13：87）分離效果及峰形最好，因而選擇此流動(dòng)相為綠原酸測定的流動(dòng)相。

提取方式的選擇方面以50%甲醇為溶劑，分別采用回流提取和超聲提取50 min，結(jié)果表明兩種提取方式無明顯差異，考慮到超聲提取易于操作，故選擇超聲提取作為含量測定的提取方式。

采用高效液相色譜法測定該品中綠原酸含量，結(jié)果顯示所采用的方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性、回收率和線性相關(guān)系良好，操作簡便，可作為該品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[1]國家藥品委員會(huì).中國藥典2005年[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：177.

[2]卓菊,孫春燕.高效液相色譜法測定茵陳清肝顆粒中綠原酸的含量[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（6）：509.

[3]黃麗丹,闞家義.降脂沖劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究 [J].中成藥，2002，24（3）：184-185.

[4]王隸書，程?hào)|巖.HPLC法測定不同產(chǎn)地的三七葉中人參皂苷Rb3的含量[J].中國藥師，2004,7(11):857-858.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局.中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分·內(nèi)科·肝膽分冊(cè)[M].北京：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002：309.

[6]衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].中藥成方制劑第十冊(cè)，1998：36.

[7]陳延清.HPLC法測定消核片中丹參素的含量[J].中草藥，2000，31（4）：269-270.

[8]呂武清，龍新華.中成藥中的薄層鑒別[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997:435，557.

Measurement of Chlorogenic Acid in Gankangning Granula by HPLC

GUO Hong-wei
Department of Pharmacy,Jining No.1 People’s Hospital,Jining,Shandong Province,272011 China

ObjectiveA reasonable,stable and effective method of measuring the content of chlorogenic acid in gankangning granula is to be established.MethodsHigh Performance Liquid Chromatography method was used to measure the content of the chlorogenic acid.Chromatographic column:ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm).Mobile phase:acetonitrile-2%Acetic acid solution(13:87).Flowrate:1mL/min,determinationwavelength:327nm.ResultsChlorogenicacidintherangeof0.32～1.93 μg linear correlation performed well.The regression equation was Y=1 025 887X-65 235,and the average recovery was 99.06%(RSD=1.10%,n=6).The correlation coefficient(r=0.999 8).The precision RSD=0.61%(n=6)and reproducibility RSD=0.56%(n=6).ConclusionThis method is stable and reliable and can be used as the quality control method of the preparation.

Gankangning granula;Chlorogenic acid;HPLC method;Content

R286.0

A

1672-5654（2017）08（a）-0036-04

2017-05-09）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.22.036

國宏偉（1981-），男，山東濟(jì)寧人，本科，主管藥師，研究方向：抗菌藥物的臨床應(yīng)用。