楊 敏，張倩玉，黃宏偉，馬 譞，王 嬌，馬 樂

(1 西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，西安 710061；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061)

葉黃素對(duì)人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

楊 敏1，張倩玉1，黃宏偉1，馬 譞2，王 嬌2，馬 樂1

(1西安交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，西安 710061；2西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 710061)

目的：外源性給予過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)構(gòu)建人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(Retinal pigment epithelial，RPE)細(xì)胞氧化損傷模型，探究H2O2的最佳建模濃度，并探討葉黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)人RPE細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法：本研究以人RPE細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。不同濃度H2O2(0、50、100、200、400、600μmol/L)處理RPE細(xì)胞1 h后，觀察細(xì)胞形態(tài)的改變，并測(cè)定細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)ROS濃度進(jìn)而確定H2O2的最佳建模濃度。不同劑量葉黃素(1、2.5、5、7.5、10μg/mL)預(yù)處理RPE細(xì)胞24h，隨后給予100μmol/L H2O2作用1h，測(cè)定各組細(xì)胞生存率和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)濃度，從而評(píng)價(jià)葉黃素對(duì)RPE細(xì)胞氧化損傷的作用。結(jié)果：H2O2作用后，隨H2O2濃度的增加，RPE細(xì)胞生存率逐步下降；細(xì)胞內(nèi)ROS濃度隨H2O2的濃度增加而顯著升高。與損傷對(duì)照組相比，各葉黃素處理組RPE細(xì)胞生存率顯著升高，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度顯著下降。結(jié)論：H2O2可導(dǎo)致RPE細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞ROS含量顯著增加。葉黃素干預(yù)后可顯著減緩H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示其可通過提高RPE細(xì)胞的生存率、抑制細(xì)胞內(nèi)ROS濃度，保護(hù)RPE細(xì)胞免受氧化損傷，從而對(duì)年齡相關(guān)性黃斑變性等眼部退行性疾病起到預(yù)防和減緩作用。

過氧化氫；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；葉黃素

年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致西方發(fā)達(dá)國(guó)家中老年人視力喪失和致盲的主要眼底疾病[1]。目前該病的確切病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，多數(shù)研究認(rèn)為其是一種與遺傳、環(huán)境、基因、代謝障礙等相關(guān)的多因素疾病[2]。視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal pigment epithelial，RPE)作為眼底的重要組織，其可通過吞噬光感受器外節(jié)盤膜、合成分泌多種生長(zhǎng)因子等途徑發(fā)揮其特定生理功能，從而維持視網(wǎng)膜正常視覺功能[3]。有研究表明，氧化應(yīng)激可引起RPE細(xì)胞功能紊亂及視網(wǎng)膜退行性改變，進(jìn)而促進(jìn)AMD的病理發(fā)展[4]。累積的活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起的氧化應(yīng)激是造成RPE細(xì)胞功能紊亂的重要使動(dòng)因素[5]。過氧化氫(H2O2)作為主要的活性氧類物質(zhì)，急性H2O2作用則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷[6]，因而其常作為細(xì)胞氧化損傷模型的誘導(dǎo)劑。

葉黃素是一種天然的優(yōu)良抗氧化劑，在機(jī)體內(nèi)可特異性富集于視網(wǎng)膜黃斑區(qū)[7-8]。既往人群葉黃素干預(yù)研究結(jié)果提示其在維持RPE細(xì)胞正常生理功能及保護(hù)視網(wǎng)膜免受氧化損傷中扮演重要角色，但其保護(hù)機(jī)制尚不明確[9-10]。因此，探討葉黃素對(duì)RPE細(xì)胞氧化損傷作用的保護(hù)機(jī)制對(duì)深入闡明AMD的發(fā)病機(jī)制具有重大意義[11]。鑒于以上研究背景，本研究外源性給予H2O2建立RPE細(xì)胞氧化損傷模型，初步探討葉黃素對(duì)視網(wǎng)膜氧化損傷的保護(hù)作用，揭示葉黃素對(duì)RPE細(xì)胞保護(hù)功能的作用機(jī)理。通過探討H2O2處理與葉黃素干預(yù)對(duì)RPE細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床上治療AMD等眼部退行性疾病提供理論依據(jù)，為進(jìn)一步深入開展葉黃素減輕AMD等眼部退行性疾病的分子機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

葉黃素(美國(guó)ChromeDex公司)；人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞A-RPE 19細(xì)胞系(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收集中心，ATCC)；改良型 RPMI-1640 培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco 公司)；青霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；鏈霉素(哈藥集團(tuán)制藥總廠)；0.25%胰蛋白酶溶液(美國(guó) Solarbio 公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；30%H2O2(西安化學(xué)試劑廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó) Bio-rad公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；倒置相差顯微鏡AE31型(Motic公司)；多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG公司)。

1.2 方法

1.2.1 RPE細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 取出液氮中的RPE細(xì)胞置于37℃水浴迅速解凍，將細(xì)胞懸液移入含培養(yǎng)液的15毫升離心管中，800r/min離心5min，棄去上清，加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%的青霉素鏈霉素混合液)，吹打混勻后將細(xì)胞懸液移入25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2、濕度為90%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，即80%～90%融合狀態(tài)時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化液消化以1：2傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 試驗(yàn)分組 H2O2實(shí)驗(yàn)正常對(duì)照組RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)1h；H2O2處理組不同濃度的H2O2(50、100、200、400、600μmol/L)培養(yǎng)1h。

葉黃素干預(yù)試驗(yàn)：損傷對(duì)照組100μmol/LH2O2培養(yǎng)1h；葉黃素干預(yù)組不同濃度的葉黃素(1、2.5、5、7.5、10μg/mL)培養(yǎng)24h后再更換100μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)1h。

1.2.3 細(xì)胞相對(duì)生存活力的測(cè)定 RPE細(xì)胞以7 000個(gè)/孔濃度接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)48h后給予不同濃度梯度H2O2干預(yù)作用1h，棄去舊培養(yǎng)液。每孔避光加入20μL 5mg/mL MTT溶液，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后小心棄去上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜溶液，微量振蕩器震蕩10min，用多功能酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)出每孔吸光度OD值。每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，依據(jù)式(1)計(jì)算各組細(xì)胞生存率：

(1)

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定 RPE細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)48h。每孔避光加入2mL新配的工作濃度為1μmol/L的DCFH-DA探針，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。棄舊培養(yǎng)液，PBS清洗3遍后給予不同濃度梯度H2O2干預(yù)作用1h。棄去培養(yǎng)液后以0.25%胰蛋白酶消化液消化制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度以7 000個(gè)/孔接種于酶標(biāo)板。以激發(fā)波長(zhǎng)502nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm的酶標(biāo)儀測(cè)出每孔熒光強(qiáng)度。每組設(shè)定5個(gè)復(fù)孔，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，依據(jù)式(2)計(jì)算每孔相對(duì)熒光強(qiáng)度。

(2)

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各組間差異。采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞的相對(duì)生存率及細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的差異，LSD法進(jìn)行兩兩組間差異比較。P<0.05可認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度H2O2處理對(duì)RPE細(xì)胞生存力和ROS水平的影響

由細(xì)胞生存率數(shù)據(jù)結(jié)果可知，隨著H2O2濃度的增大，細(xì)胞生存率逐漸下降；不同組細(xì)胞生存率具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；50組與對(duì)照組及100組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；其余組間兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。ROS檢測(cè)結(jié)果表明H2O2濃度越高，細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度比值越大，細(xì)胞ROS水平越高。對(duì)照組與50μmol/L組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖1～2)。

圖1 不同濃度H2O2處理對(duì)RPE細(xì)胞生存力的影響

圖2 不同濃度H2O2處理對(duì)RPE細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響注：與對(duì)照組比較，**P<0.01

2.2 葉黃素對(duì)H2O2氧化損傷后RPE細(xì)胞生存率的影響

通過比較H2O2氧化損傷對(duì)照組和不同濃度葉黃素干預(yù)H2O2損傷后RPE細(xì)胞的細(xì)胞生存率可知，葉黃素濃度越高，則生存率越高。葉黃素濃度為10μg/mL時(shí)，細(xì)胞生存率較7.5μg/mL處理組下降，但仍高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。組間兩兩比較，7.5μg/mL處理組與10μg/mL處理組細(xì)胞生存率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖3)。

圖3 葉黃素對(duì)H2O2損傷后RPE細(xì)胞的細(xì)胞生存率的影響注：與損傷對(duì)照組比較，**P<0.01、*P<0.05

2.3 葉黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的影響

不同濃度葉黃素預(yù)處理RPE細(xì)胞，各組間細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與損傷對(duì)照組相比，葉黃素各處理組較對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；葉黃素處理組組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(附表、圖4)。

附表 不同濃度葉黃素預(yù)處理RPE細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度

圖4 葉黃素對(duì)H2O2損傷后RPE細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的影響注：與損傷對(duì)照組比較，**P<0.01、*P<0.05

3 討論

在自然生理?xiàng)l件下，隨著年齡的增長(zhǎng)，人RPE細(xì)胞處于慢性、累積性的氧化損傷，逐步引起人RPE細(xì)胞正常生理功能紊亂，最終誘導(dǎo)RPE細(xì)胞凋亡壞死[12]。既往研究者主要采用藍(lán)光照射和H2O2處理兩種模型，實(shí)驗(yàn)證明兩種處理方法都可成功誘導(dǎo)RPE細(xì)胞內(nèi)ROS生成[13-14]。本研究結(jié)果顯示，外源性50～600 μmol/L H2O2作用1 h后，可導(dǎo)致體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞活力呈現(xiàn)濃度依賴性顯著降低，濃度越高，細(xì)胞損傷越重。此外，隨H2O2濃度的增加凋亡程度增加，且與對(duì)照組相比ROS濃度明顯增高，提示H2O2可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷，其程度隨H2O2濃度的增加而逐漸加重。為模擬自然條件，本研究采用有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最小濃度(100 μmol/L H2O2)處理RPE細(xì)胞建立氧化損傷模型。H2O2是一種可在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮廣泛生物介質(zhì)效應(yīng)的重要ROS，極易透過細(xì)胞膜，可與細(xì)胞內(nèi)Fe2+通過Fenton反應(yīng)生成高活性的自由基。短時(shí)間內(nèi)暴露于H2O2環(huán)境中則會(huì)引起細(xì)胞正常代謝功能紊亂，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、促進(jìn)RPE細(xì)胞凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的ROS超過其本身清除能力，視網(wǎng)膜上積累的ROS損傷線粒體DNA(mtDNA)，氧化系統(tǒng)與抗氧化平衡系統(tǒng)逐步失衡，引起黃斑中心凹受到氧化應(yīng)激的損害，最終導(dǎo)致與年齡相關(guān)的損傷，加速了AMD的發(fā)生、發(fā)展[16-17]。

葉黃素是一種存在于視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的含氧類胡蘿卜素，其自身不能轉(zhuǎn)化生成維生素A，但在維持人體正常視覺功能中扮演重要角色。其化學(xué)結(jié)構(gòu)含有多個(gè)不飽和共軛雙鍵且鏈末端為烴基，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其具有抗氧化作用，從而發(fā)揮獨(dú)特而強(qiáng)大的生理功能[8，18]。近期研究發(fā)現(xiàn)，葉黃素是視網(wǎng)膜黃斑色素的主要成分，機(jī)體攝入葉黃素后可選擇性地富集于視網(wǎng)膜黃斑部位，在維持視網(wǎng)膜正常生理功能及預(yù)防視網(wǎng)膜損傷中發(fā)揮重要作用[7，19]。本研究結(jié)果顯示，葉黃素可顯著提高H2O2氧化損傷后RPE細(xì)胞的生存率。葉黃素10 μg/mL組與葉黃素7.5 μg/mL組比較細(xì)胞生存率有所下降，但仍顯著高于損傷對(duì)照組。猜測(cè)高劑量的葉黃素可能具有輕微的細(xì)胞毒性，在后續(xù)的研究中需進(jìn)一步的驗(yàn)證。在對(duì)RPE細(xì)胞給予H2O2處理前葉黃素干預(yù)24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS濃度較損傷對(duì)照組明顯下降，但未明顯表現(xiàn)出呈劑量濃度依賴性下降。提示葉黃素可能是通過ROS清除作用進(jìn)而減輕其對(duì)RPE細(xì)胞的氧化損傷，從而保護(hù)RPE細(xì)胞。葉黃素的保護(hù)機(jī)制可能是其可有效清除機(jī)體產(chǎn)生的ROS，淬滅大量的單氧基團(tuán)和過氧化自由基，從而抑制脂類氧化反應(yīng)，抵御氧化應(yīng)激造成的繼發(fā)性細(xì)胞損傷，進(jìn)一步保護(hù)視網(wǎng)膜[20]。已有流行病學(xué)研究證實(shí)一定量的葉黃素?cái)z入可使AMD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下降。AMD患者補(bǔ)充葉黃素，可提高視網(wǎng)膜黃斑色素密度，減緩黃斑的退化速度，從而提高早期AMD患者的視力水平[21-24]。提示適量增加葉黃素的攝入量可預(yù)防年齡相關(guān)性眼部退行性疾病的發(fā)生。

綜上所述，外源性H2O2作用下，RPE細(xì)胞內(nèi)ROS濃度明顯增高，細(xì)胞生存率呈呈劑量依賴性下降；葉黃素干預(yù)后RPE細(xì)胞生存率明顯提高，細(xì)胞內(nèi)ROS濃度亦明顯下降。提示其通過抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)從而減輕H2O2對(duì)RPE細(xì)胞的損傷作用。葉黃素通過清除ROS過氧化自由基、減少脂質(zhì)過氧化、抑制炎癥因子表達(dá)等途徑保護(hù)RPE細(xì)胞并抑制AMD等眼部退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此膳食提高葉黃素等天然抗氧化物及其他抗氧化劑的攝入量，維持視網(wǎng)膜氧化狀態(tài)平衡對(duì)AMD等眼部退行性疾病的緩解及治療具有重大意義?！?/p>

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[24]馬婷婷，滕倩，梁惠，等.葉黃素持續(xù)補(bǔ)充對(duì)機(jī)體葉黃素水平及抗氧化能力影響研究[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2016，22(5)：61-65.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Protective Effect of Lutein on Human RPE Cells from Oxidative Stress

YANG Min1，ZHANG Qian-yu1，HUANG Hong-wei1，MA Xuan2，WANG Jiao2，MA Le1
(1School of Public Health，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China；2The First Affiliated Hospital Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

H2O2；retinal pigment epithelial cell；oxidative stress；lutein

國(guó)家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81202198)。

楊敏(1993— )，女，碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)流行病學(xué)。

馬樂(1983— )，男，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與慢性病。