何學青， 沙亞·海拉提， 龍明秀， 梁玉生， 陶奇波， 呼天明

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院， 陜西 楊凌 712100)

近些年來,由于世界人口的不斷增長和工業(yè)化的加劇，引起了能源危機和一系列環(huán)境問題,例如全球變暖、大氣污染等，所以，人們開始尋求清潔的生物質(zhì)能源以取代化石燃料。生物質(zhì)能源原料包括非糧能源植物、農(nóng)業(yè)廢棄物和城市廢棄物等，非糧能源植物是當前的研究熱點[1]。美國對具有生物能源特性的草本作物進行篩選后將焦點聚集在了柳枝稷上[2]。柳枝稷(PanicumvirgatumL.)屬于禾本科(Gramineae)黍?qū)?Panicum)，是一種原產(chǎn)于北美的暖季型C4植物，具有極強的適應性和遺傳多樣性[3-4]。由于柳枝稷富含纖維素，產(chǎn)量高，并且可以在貧瘠的地方生長，不會占用適于種植糧食的耕地，其利用不會對環(huán)境造成污染和破壞，符合作為有益生物燃料的條件[5]，美國能源部已將柳枝稷作為一種專一的能源模式作物[6]。由于柳枝稷主要靠種子繁殖后代，當柳枝稷作為一種能源作物大面積種植時，種子不足可能會成為柳枝稷大面積種植的限制因子[7]。5%的種子含水量和-4℃低溫干燥條件作為國際上貯藏種質(zhì)資源的理想條件[8]，但此貯藏方式耗能比較大，對于發(fā)展中國家是一個很大的負擔。種子超干貯藏是由原國際植物遺傳資源委員會(IBPGR)也就是現(xiàn)在的國際植物遺傳資源研究所首次提出的[9]。所謂超干貯藏即采用超干燥方法將種子含水量降到較低程度后在常溫條件下對其密封貯藏，以達到部分或全部取代低溫庫的目的[10]。

經(jīng)過20多年的研究，在超干方法、超干種子材料、最適含水量的確定和超干作用機理等方面取得了一系列的研究進展[11]。超干貯藏研究對象主要是蔬菜、瓜果、豆類、谷物、藥用植物和樹木的種子，近幾年來，有些學者也逐步開展了一些針對牧草如新麥草(Psathyrostachysjuncea)[12]、菊苣(Cichoriumintybus)[13]、柱花草(Stylosanthesguianensis)[14]、披堿草(Elymusdahuricus)[15]和山竹巖黃芪(Hedysarumfruticosum)[16]等種子的超干貯藏研究，結(jié)果表明超干貯藏技術(shù)適用于牧草種子的貯藏。大量研究表明，在采用超干貯藏技術(shù)對種子進行貯藏時，種子的最適含水量在不同溫度下有所不同，同時也不是含水量越低就越有利于貯藏[17]。一般種子的含油量高其耐干性也較高，油質(zhì)種子較淀粉種子更容易降低水分，大粒種子與小粒種子相比較而言更不易于干燥和保存[11,18]。淀粉含量高的種子比蛋白質(zhì)含量高的種子更耐干燥，其安全臨界水分也較低[19]。目前尚未發(fā)現(xiàn)一種適宜的方法用來測定不同類型種子的安全水分下限[20]。

目前對柳枝稷種子進行超干貯藏的研究還鮮有報道。本試驗采用硅膠干燥的方法制備不同含水量的柳枝稷種子，研究不同程度超干處理對種子活力及幼苗生長前期狀況的影響，以期為柳枝稷種子的超干貯藏提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柳枝稷種子品種為‘Alamo’，采集于中國科學院寧夏回族自治區(qū)固原生態(tài)試驗站，收獲年份為2012年。種子風干清選后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，根?jù)牧草種子檢驗規(guī)程[21]測得種子的初始含水量為9%。

1.2 種子處理

1.2.1超干處理 在室溫條件下采用硅膠干燥法對含水量為9%的柳枝稷種子進行超干處理，制備含水量分別為7%，5%，3%，2%和1%的種子。稱取5份重量約1.845 g的柳枝稷種子將其置于雙層紗布中并做標記，將標記好的樣品放入盛有硅膠的干燥器內(nèi)，25℃恒溫條件下脫水干燥，定期對干燥器內(nèi)的硅膠進行干燥冷卻。逐日對干燥處理中的種子進行稱重，待種子重量分別降至約為1.808，1.771，1.734，1.719和1.697 g左右時將紗布和種子從干燥器中取出，之后將不同含水量的柳枝稷種子置于鋁箔袋密封備用。

1.2.2回濕處理 發(fā)芽試驗前，采用回濕平衡水分法對種子進行回濕處理。依次放入由飽和NH4Cl 溶液以及水所形成的相對濕度環(huán)境的系列干燥器中，密封，分別在室溫下平衡24 h。

1.2.3種子發(fā)芽 隨機選取超干處理后的不同含水量的柳枝稷種子各150粒，每組設(shè)3個重復，每重復50粒，置于培養(yǎng)皿中。用未進行超干處理的種子(含水量9%)作對照。最后，將培養(yǎng)皿置于人工氣候箱中，在溫度為25℃(光照8 h，黑暗16 h)，相對濕度(RH)為80%條件下培養(yǎng)。每天向培養(yǎng)皿中加適量的蒸餾水以滿足種子萌發(fā)的正常生長，并逐日統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)。當種子“露白”時則視為發(fā)芽，發(fā)芽持續(xù)14 d，在發(fā)芽試驗末期統(tǒng)計正常幼苗種子數(shù)、不正常幼苗種子數(shù)、休眠種子數(shù)和死種子數(shù)。

1.3 指標測定

1.3.1發(fā)芽指標的測定 根據(jù)如下公式計算發(fā)芽相關(guān)的指標：

活力指數(shù)(VI)=發(fā)芽率(%)×幼苗鮮重(g)。

1.3.2種子浸出液電導率的測定 隨機選取含水量分別為9%，7%，5%，3%，2%，1%的柳枝稷種子各150粒，設(shè)置3個重復，每個重復50粒，并用分析天平測定每50粒種子的重量(g)，精確度至0.01 g。稱重后的種子分別裝入150 mL的三角瓶中，加入100 mL蒸餾水，充分搖蕩使種子沉入瓶底，用保鮮膜封住瓶口，并標記。以僅盛100 mL蒸餾水的三角瓶作為空白對照。將種子瓶及對照置于25℃的黑暗條件下，24 h后取出，在25℃條件下，用DDS-11C型數(shù)字式電導率儀測定浸種液的電導率。按下式計算各種樣的電導率。

電導率(μs·cm-1·g-1)=

1.3.3幼苗生長指標的測定 發(fā)芽末期從每個培養(yǎng)皿中隨機選取10株幼苗，用葉面積分析儀(Yaxin 1240)測定幼苗葉面積的大小和苗長，用直尺測定幼苗根長，用電子天平對幼苗的干重及鮮重進行稱量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003 錄入并作圖，采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行One-way ANOVA 進行單因素方差分析，采用Duncan’s 法對平均值進行多重比較并對各指標做Person相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超干處理對柳枝稷種子活力的影響

2.1.1超干處理對柳枝稷種子發(fā)芽的影響 由圖1可知，超干處理組柳枝稷種子的發(fā)芽勢與對照的發(fā)芽勢之間沒有顯著差異，且在超干處理組間柳枝稷種子的發(fā)芽勢差異均不顯著，但含水量為3%的

柳枝稷種子的發(fā)芽勢最高。超干處理后的柳枝稷種子發(fā)芽率與對照之間的差異不顯著，但在超干處理組中含水量為3%和2%的柳枝稷種子發(fā)芽率差異顯著。由表1可知，超干處理后種子萌發(fā)的正常幼苗數(shù)和異常幼苗數(shù)，均與對照處理無顯著差異。超干處理后休眠種子數(shù)和死種子數(shù)均較對照有所增加。

圖1 超干處理對柳枝稷種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of ultra-dry treatment on germinationpotential and germination rate of switchgrass注：圖中不同小寫字母表示不同含水量間差異顯著(P<0.05)，下同Note: different lowercase letters indicatesignificant difference between moisturecontent at the 0.05 level, the same as below

表1 超干處理對柳枝稷種子最終萌發(fā)的影響Table 1 Effect of ultra-dry treatment on the final germination of switchgrass

含水量Moisture content/%正常幼苗Normal seedling/%異常幼苗Abnormal seedling/%休眠種子Dormant seed/%死種子Dead seed/%9 90.00±1.00ab4.00±0.00a5.34±0.58b0.66±0.058c7 89.94±2.52ab2.66±0.58a 6.00±1.00ab2.00±1.00b5 86.66±1.16ab2.66±0.58a8.66±0.58a2.00±1.00b3 85.00±1.00b3.72±0.58a8.00±1.00a3.34±0.58ab283.27±3.10b4.66±0.58a6.66±0.58ab5.34±2.52a1 88.66±0.58ab4.00±1.00a6.00±1.00ab1.34±0.58b

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值±標準差,同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Note: means±standard deviation, different lowercase letters indicate significant difference between moisture content at the 0.05 level, the same as below

2.1.2超干處理對柳枝稷種子活力指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)的影響 由圖2可知，除含水量為1%的柳枝稷種子活力指數(shù)與對照之間差異顯著(P<0.05)之外，其他超干處理組與對照無顯著差異。而且在超干處理組中含水量為7%，5%，3%，2%的柳枝稷種子活力指數(shù)與含水量1%的柳枝稷種子相比較差異顯著(P<0.05)。超干處理組中含水量為1%的柳枝稷種子的發(fā)芽指數(shù)與對照之間差異顯著(P<0.05)且與超干處理組中含水量為7%，5%，3%，2%的柳枝稷種子的發(fā)芽指數(shù)差異顯著(P<0.05)。以上結(jié)果表明，超干處理后含水量為1%的柳枝稷種子活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)與對照相比均較低，并且在活力指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)這兩個指標上與對照差異顯著(P<0.05)。因此，含水量降低到1%時柳枝稷種子活力降低。

圖2 超干處理對柳枝稷種子活力指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.2 Effect of ultra-dry treatmenton vigor index and germination indexof switchgrass

2.1.3超干處理對種子浸出液相對電導率的影響 由圖3可知，超干處理后柳枝稷種子浸出液的電導率與對照電導率差異不顯著，但在超干處理組中，含水量為2%和1%的柳枝稷種子浸出液相對電導率之間存在顯著差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明，超干處理后柳枝稷種子的外滲電解質(zhì)與對照種子的外滲電解質(zhì)差距不大，即超干處理沒有對柳枝稷的細胞膜系統(tǒng)造成損傷，表明柳枝稷種子具有較強的耐干性。

圖3 超干處理對柳枝稷種子浸出液相對電導率的影響Fig.3 Effect of ultra-dry treatment on relativeelectrical conductivity of switchgrass

2.2 超干處理對柳枝稷幼苗生長的影響

2.2.1超干處理對柳枝稷幼苗根長、苗長及葉面積的影響 由圖4可知，隨著超干處理程度的不斷加深，幼苗苗長呈增加趨勢，且含水量為1%的柳枝稷種子的幼苗與對照之間差異顯著。超干處理后幼苗的根長與對照之間無顯著差異。種子含水量從5%降低到1%時，幼苗根長逐漸增長，含水量為1%的柳枝稷幼苗根長達到最大值。超干處理組含水量為3%和1%的柳枝稷幼苗葉面積與對照之間的差異顯著(P<0.05)，且超干處理組的葉面積值均高于對照。以上結(jié)果表明，超干處理影響了幼苗的生長，且葉面積和苗長大致呈增大趨勢。

圖4 超干處理對柳枝稷幼苗生長的影響Fig.4 Effect of ultra-dry treatment on seedlinggrowth of switchgrass

2.2.2超干處理對柳枝稷幼苗鮮重及干重的影響 由圖5可知，超干處理組幼苗鮮重及干重與對照差異均不顯著。由此可知，超干處理對于幼苗鮮重和幼苗總干物質(zhì)積累影響不大。

圖5 超干處理對柳枝稷幼苗鮮重和干重的影響Fig.5 Effect of ultra-dry treatment onfresh weight and dry weight ofswitchgrass seedlings

2.3 柳枝稷種子活力各指標之間的相關(guān)性分析

由表2可知，柳枝稷種子的含水量與發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)呈一定的正相關(guān)性且與活力指數(shù)的相關(guān)性極顯著。因此，含水量與種子活力相關(guān)性較大。但含水量和幼苗苗長、葉面積有極顯著的負相關(guān)性且與葉面積之間的相關(guān)性稍大于苗長，這表明種子含水量與幼苗生長密切相關(guān)。發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)與相對電導率均無顯著相關(guān)性，故對于柳枝稷種子而言，相對電導率值不能真實的反映超干處理后種子活力的大小。鮮重與發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)之間的相關(guān)性顯著，葉面積與發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)之間具有顯著負相關(guān)性，所以，種子活力會影響幼苗鮮重和葉面積。

表2 柳枝稷種子活力與部分測定指標之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlations analysis between some indicators of switchgrass and seed vigor

注：MC：Moisture content；GR：Germination rate；GP：Germination potential；GI：Germination index；VI：Vigor index； REC：Relative electrical conductivity；RL：Root length； LA：Leaf area；DW：Dry weight；FW：Fresh weight；RSR：Root/shoot ratio；LF：Leaf length；*表示在0.05 水平上顯著相關(guān)，**表示在0.01 水平上顯著相關(guān)

Note: * indicate significant correlation at the 0.05 level; ** indicate significant correlation at the 0.01 level

3 討論

在種質(zhì)資源的貯藏過程中，貯藏溫度和種子含水量是決定種子貯藏效果的兩個關(guān)鍵因素。有一些正常型種類的種子能進一步脫水到1%～5%而不對其造成傷害[22]。柳枝稷種子自然成熟狀態(tài)下含水量在9%左右，經(jīng)超干處理降低到2%時其活力并未發(fā)生顯著變化。由此可知，柳枝稷種子屬于正常型種子，其耐干性比較好且種子成熟時的含水量已經(jīng)較為適宜它的貯藏。原因可能是柳枝稷能夠適應較為惡劣的生長環(huán)境，自身耐旱性強，為保證種子的正常萌發(fā)和壽命延長而進行的自然選擇。

種子內(nèi)的水分按狀態(tài)主要分為3類，分別為自由水、束縛水和中間過度型水，超干處理主要是降低種子內(nèi)的自由水[23]。因為束縛水與多糖和蛋白質(zhì)大分子的結(jié)合比較緊密，種子一旦失去較多束縛水就會造成大分子結(jié)構(gòu)的損傷從而破壞種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，最終導致種子活力下降[11]。試驗結(jié)果表明柳枝稷種子含水量從9%脫水至2%的過程中種子活力差異不大，但是，當水分降至1%時，種子活力顯著降低。因為柳枝稷種子屬于淀粉類種子，含有大量的多糖，當含水量降至1%時可能由于束縛水失去的比例過大而導致種子活力急劇降低。這從某種程度上也證實了超干處理會提高種子活力，但并不是含水量降得越低種子活力就越高，在相同溫度下對超干種子貯藏時存在一個適宜貯藏含水量范圍[24]。該試驗中關(guān)于超干處理對柳枝稷活力影響的結(jié)果與徐煒等[15]對披堿草種子常溫超干貯藏的結(jié)果不一致，而柳枝稷與披堿草均屬于禾本科植物，它們的種子富含淀粉，這也證實了淀粉類種子的耐干性在種間差異大[11]。

根長、苗長、根冠比、鮮重和葉面積是研究柳枝稷幼苗生長常用的指標，反映了柳枝稷幼苗生長的好壞和幼苗健壯的潛能[25]。本試驗中不同超干處理與對照所測得的以上指標之間無顯著差異，所以，超干處理對幼苗的生長沒有顯著影響。但葉面積隨著種子含水量的降低有增加趨勢，并且幼苗的根長在種子脫水至5%時與含水量為2%和1%的幼苗根長差異顯著，但超干處理后幼苗的干重與鮮重較對照并無顯著差異。相關(guān)性分析顯示幼苗鮮重與發(fā)芽指數(shù)相關(guān)性顯著且與活力指數(shù)的相關(guān)性極顯著，所以，鮮重在某種程度上可以反映種子活力的大小。由于超干處理對種子而言就是一種脫水脅迫，能誘導種子內(nèi)部滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和抗氧化酶含量增高等生理生化變化[26]，葉面積增大與根增長可能是植物對種子失水的一種補償作用以確保超干種子出苗后的正常生長。

細胞膜系統(tǒng)的完整性是保證種子活力的重要因素之一，多數(shù)研究表明種子浸出液的電導率與種子活力顯著相關(guān)[27]，因為細胞膜的完整性受到損傷后會導致膜透性增大，從而導致較多的電解質(zhì)滲漏到周圍溶液中[28]。所以，通過測定種子浸出液的電導率可以推斷出細胞膜的完整程度。而本研究結(jié)果表明相對電導率與種子活力之間的相關(guān)性不顯著，與菜豆(PhaseolusvulgarisL.)[27]和斧翅沙芥(PugioniumdolabratumMaxim)[22]種子超干貯藏的研究結(jié)果相似。因此，電導率不能夠作為衡量柳枝稷種子活力大小的指標。

綜上所述，當柳枝稷種子含水量降到1%時，種子活力指數(shù)與發(fā)芽指數(shù)較對照顯著下降，表明種子含水量降到1%時對種子萌發(fā)有一定的抑制作用。因此，柳枝稷種子貯藏時的安全水分下限為2%。將柳枝稷種子超干處理含水量降低為2%～7%時，柳枝稷種子仍然保持較高活力，且超干貯藏不會對幼苗前期生長造成不利影響。但超干處理后的柳枝稷種子活力較對照而言并沒有顯著提高，說明在自然狀態(tài)下柳枝稷種子含水量已經(jīng)比較適于保存。目前而言，如果有對柳枝稷種子進行超干貯藏的必要，可考慮將柳枝稷種子含水量降到3%進行貯藏。因為，此時種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)在超干處理組和對照之中均取得最大值，而且活力指數(shù)也較高。由于本試驗持續(xù)時間較短，并不能說明自然狀態(tài)下成熟的柳枝稷種子適宜在常溫下長期保存，所以，有關(guān)柳枝稷種子超干貯藏方面的研究還有待進一步探索。

4 結(jié)論

柳枝稷種子屬于正常型種子，具有極強的耐干性；柳枝稷種子含水量降為3%時，種子活力達到最大，超干處理后的安全水分下限是2%；適當?shù)某商幚砦茨苁沽︷⒎N子保持較高活力且不會對幼苗前期的干物質(zhì)積累造成顯著影響；柳枝稷種子浸出液的電導率不能反映其種子活力的大小。