樊文娜， 李潤林， 王占彬， 杜紅旗， 趙凌平， 王成章*

(1. 河南科技大學動物科技學院， 河南 洛陽 471003；2. 河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院， 河南 鄭州 450002)

苜蓿(Medicagosativa)的秋眠性(Fall Dormancy)是苜蓿在秋季因日照長度變短和氣溫下降所表現(xiàn)出的一種適應(yīng)性生長特性[1-2]，是選擇栽培苜蓿品種時考慮的首要指標。從本質(zhì)上講，秋眠性是對日照長度的反應(yīng)，短日照是其主要的影響因子[3]。苜蓿作為長日照植物，晚春及夏季長日照條件下有利于其生長發(fā)育，秋冬季短日照則休眠，說明苜蓿秋眠存在光周期效應(yīng)[4]。

目前，研究已發(fā)現(xiàn)的前3種光信號接受的光受體[5-8]，即紅光和遠紅光的受體——光敏色素(Phytochrome )、藍光受體和紫外光受體(UV-receptor)。隱花色素(Cryptochrome)在植物中是很重要的感受光受體，是光形態(tài)建成反應(yīng)的必需元素，但在苜蓿的秋眠中發(fā)揮的作用機理目前還未知。高等植物受藍光調(diào)節(jié)的反應(yīng)主要包括：向光性、抑制莖芽的生長、葉綠體的轉(zhuǎn)移、刺激氣孔張開和關(guān)閉，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。藍光光受體——隱花色素可以調(diào)控植物開花時間以及晝夜節(jié)律循環(huán)[9]，CRY2B(Cryptochrome2B)是主要接受和傳遞光信息的藍光受體，并且紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果差異基因的統(tǒng)計也證明，調(diào)控苜蓿秋眠的藍光受體CRY2B的Log2(Fold Change)[10-11]是最大的，這證明CRY2B作為重要的光受體在調(diào)控苜蓿的秋眠中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

本研究擬構(gòu)建紫花苜蓿藍光受體CRY2B過表達載體，過表達載體的構(gòu)建本質(zhì)上是基因重組的過程。構(gòu)建紫花苜蓿藍光受體CRY2B過表達載體是獲得紫花苜蓿CRY2B轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵步驟和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1植物材料 供試的紫花苜蓿(Medicago

sativaL.)品種為一級品種‘馴鹿’，由河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院草業(yè)科學實驗室培養(yǎng)提供，采集葉片后迅速放入液氮速凍后-80℃保存。

1.1.2菌株 大腸桿菌(Escherichia．coli)DH5α，農(nóng)桿菌菌株GV3301，均由河南農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學實驗室提供。

1.2 載體

克隆載體pMDl8-T(Takara)；

植物表達載體pCAMBIA3301含有CaM 35 S啟動子和Nos polyA終止子(圖1)。

圖1 pCAMBIA3301結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Diagram of Pcambia3301

1.3 試驗方法

1.3.1CRY2B基因引物設(shè)計 引物設(shè)計前分析序列(紫花苜蓿基因組測序尚未完成，結(jié)合紫花苜蓿轉(zhuǎn)錄組測序信息，以模式植物蒺藜苜蓿CRY2B基因為模板 ，NCBI登錄ID:XM-003589988.1)，基因序列編碼區(qū)696-2498(即CRY2B完整的開放閱讀框)，設(shè)計引物擴增出來的目的片段要包含此閱讀框，如下：AATCTGAAAATAGGTATGAATAGGACCATAGTT-TGGTTTAGGAGGGACCTAA-GAATTGAGGACAA………TACCATAACAATGTTCCTCT-CCTCTTCTACTAATATAAAGTT-GTCATGGTAAGAACATAG(加粗部分劃線為CRY2B起始密碼子和終止密碼子，目的基因過表達要求引物設(shè)計的長度從起始密碼子和終止密碼子，含完整的開放閱讀框)。

利用Premier 5設(shè)計引物，選擇過表達載體上NcolI、PmlI為酶切位點(同時對植物表達載體pCAMBIA3301和目的基因CRY2B進行雙酶切)，在設(shè)計好的CRY2B引物(696-2553)上加入酶切位點(劃線部分為限制性酶切位點)，為保證酶切質(zhì)量，酶切位點前面為保護堿基(表1) ，并送生工生物(上海)股份有限公司。

表1 基因引物序列Table 1 The primers of CRY2B gene

1.3.2CRY2B基因克隆與測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段，進行PMD18-T克隆轉(zhuǎn)化，菌液PCR檢測為陽性后送上海生工測序。測序結(jié)果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行比對，CRY2B克隆成功。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，保存并命名為PMD18-T-CRY2B。

1.3.3純化回收的產(chǎn)物與PMD-18T載體的連接 采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，嚴格按照回收試劑盒的操作步驟進行，回收到的產(chǎn)物置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

純化回收產(chǎn)物CRY2BPMD-18T載體連接前，使用BspHI/PmlI內(nèi)切酶，分別雙酶切CRY2B目的片段和植物表達載體pCAMBIA3301，為提高CRY2B和pCAMBIA3301載體兩個目的片段的酶切效率和準確性，先將目的片段與PMD-18T載體連接，增加CRY2B目的片段的拷貝數(shù)。

DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，用于擴繁、培養(yǎng)，進行PCR鑒定。

1.3.4提取陽性克隆DNA質(zhì)粒 利用百泰克公司小量質(zhì)粒提取試劑盒提取，嚴格按照提取質(zhì)粒試劑盒的操作步驟進行。

1.3.5含有T載體的CRY2B片段質(zhì)粒與pCAMBIA3301質(zhì)粒雙酶切 在冰上進行操作，反應(yīng)液混勻后37℃酶切反應(yīng)1 h。

1%的瓊脂糖凝膠電泳觀測酶切效果，對酶切正確的目的片段進行切膠純化回收，以備連接反應(yīng)。

1.3.6連接反應(yīng) 將純化回收酶切后的CRY2B目的片段連接到酶切后的pCAMBIA3301上，連接反應(yīng)目的片段與載體的濃度摩爾比例為1:6～10。

表2 雙酶切反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of restriction endonuclease

1.3.7連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及鑒定 pCAMBIA3301載體與CRY2B目的片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化操作同上述DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化步驟，由于載體pCAMBIA3301含有Kan、Amp的特性，所以配制含有Kan、Amp特性的LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化后對含有目的片段菌液進行PCR檢測。PCR檢測為陽性克隆的菌液進行測序并提取質(zhì)粒，長期保存，然后進行酶切檢測。

1.3.8酶切檢測 由于CRY2B基因上游添加的酶切位點是NcolI的同尾酶BspHI，因此重新整合的重組質(zhì)粒不能用原來的酶切位點NcolI或PmlI去進行酶切鑒定，利用generunner分析可知，CRY2B基因片段上含有和pCAMBIA3301載體上相同的酶切位點EcoR1，此酶切位點不在pCAMBIA3301載體的表達區(qū)。利用EcorI進行酶切，若瓊脂糖凝膠電泳得到10 000 bp和2 000 bp大小的兩個片段(可根據(jù)pCAMBIA3301載體序列酶切位點的分析和CRY2B基因擴增長度判斷)，則說明目的片段pCAMBIA3301-CRY2B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，如果沒有得到兩個片段，則質(zhì)粒重組不成功。

1.3.9農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCAMBIA3301-CRY2B轉(zhuǎn)化苜蓿植株 質(zhì)粒為上述試驗構(gòu)建的MBIA3301-CRY2B過表達載體，首先制備農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，然后選擇粒大飽滿的‘馴鹿’紫花苜蓿種子，使用清水沖洗30 min，然后75% 的酒精浸泡3 min進行消毒，棄溶液，然后用0.1%HgCl2(氯化汞)溶液滅菌15 min，再用無菌水清洗3～5次，將種子置于多層無菌濾紙上直至吸去多余水分，用已滅菌的鑷子將種子接種到MS培養(yǎng)基上(30 g·L-1蔗糖和2.5 g·L-1Phytagel)。將接種的培養(yǎng)基放入光照培養(yǎng)箱里，在白晝光周期為16 h/8 h，白晝溫度為22/20℃的條件下培養(yǎng)，采用直接分化芽再生途徑的方法進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCAMBIA3301-CRY2B重組載體轉(zhuǎn)化紫花苜蓿[12-16]。

1.3.9.1 農(nóng)桿菌的侵染

(1)在含重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-CRY2B農(nóng)桿菌的YEB(50 mg·L-1kan+100 mg·L-1rif)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h左右。

(2) 2 d后，用牙簽挑取單菌落，接種于含有50 mg·L-1kan和100 mg·L-1rif的20 mL YEB液體培養(yǎng)基中，28℃ 200～220 rpm震蕩培養(yǎng)16～24 h， OD600=0.5～0.7，用于外植體的侵染。

(3)將切割好的子葉放入準備好的農(nóng)桿菌菌液中侵染60 min(隔10 min輕微晃動1次)，使農(nóng)桿菌能夠充分接觸子葉節(jié)的傷口。接著將侵染過的子葉轉(zhuǎn)移到干燥的無菌濾紙上，吸去表面多余的菌液，然后接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(光照培養(yǎng)箱24℃黑暗培養(yǎng)，3～4 d)。

1.3.9.2 芽誘導(dǎo)和篩選

共培養(yǎng)后的子葉轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，注意把生長點插入培養(yǎng)基以保證子葉的生長方向，不定芽直立向上生長，并且子葉節(jié)處的傷口能夠接觸到培養(yǎng)基[17-20]。培養(yǎng)條件為光周期：16 h/8 h，溫度：白晝25℃/22℃。轉(zhuǎn)化成功的植株會在子葉節(jié)的傷口處直接分化出不定芽，且不定芽出現(xiàn)后會迅速生長。未轉(zhuǎn)化成功的外植體會逐漸變黃、發(fā)褐甚至死亡。

1.3.9.3 誘導(dǎo)生根

選擇芽誘導(dǎo)長勢較好且已長有小根須的樣本，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有生根培養(yǎng)基(1/2MS+Yeastextract +carb)的三角瓶(瓶口較大，太小容易污染)中，用封口膜將錐形瓶口封緊，放入光照培養(yǎng)箱，設(shè)置培養(yǎng)條件，光照時間和溫度：16 h(25℃)/黑暗時間和溫度8 h(22℃)。誘導(dǎo)根生長30天左右，幼苗主根茁壯，接近于正常的植株。

1.3.9.4 煉苗移栽

當苜蓿轉(zhuǎn)基因植株根部產(chǎn)生多條粗而壯的根須時，可以進行煉苗，即對三角瓶內(nèi)的轉(zhuǎn)基因幼嫩植株進行馴化，以適應(yīng)外界生長條件[21]。打開三角瓶瓶口，加入一定量的滅菌去離子水(避免出現(xiàn)干燥應(yīng)激)。在光照培養(yǎng)箱中生長4～6 d，將幼苗從三角瓶中取出，沖洗根部的培養(yǎng)基(一定要沖洗干凈，避免病菌滋生使根部壞死)。之后將轉(zhuǎn)基因苜蓿植株移栽于混有營養(yǎng)土/蛭石(1:1)的小花盆中。當苜蓿

植株長出健壯莖葉時，即可進行轉(zhuǎn)基因陽性苗的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRY2B克隆PCR擴增效果

根據(jù)克隆的基因以及所需的酶切位點設(shè)計CRY2B引物，進行PCR擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果如圖2所示，目的片段條帶清晰明亮，可進行目的片段純化回收。

圖2 CRY2B PCR 擴增Fig.2 Electrophoresis of the product of CRY2B PCR amplificationM: DNA分子量標記；1-2: CRY2BM: DNA ladder; 1-2: CRY2B

2.2 pCAMBIA3301載體與CRY2B目的片段連接的菌液PCR檢測

將純化回收酶切后的CRY2B目的片段連接到酶切后的pCAMBIA3301連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌過夜培養(yǎng)。根據(jù)克隆的CRY2B基因以及所需的酶切位點所設(shè)計的引物，以菌液為模板，進行PCR擴增檢測。擴增出如圖3清晰明亮的目的片段，說明目的片段已經(jīng)成功連接到pCAMBIA3301載體上，可以進行測序鑒定與酶切反應(yīng)。

圖3 CRY2B 菌液PCR 擴增Fig.3 CRY2B bacteria PCR amplificationM: DNA分子量標記；1-2: CRY2BM: DNA ladder; 1-2: CRY2B

2.3 pCAMBIA3301載體與CRY2B目的片段連接產(chǎn)物的酶切效果與分析

pCAMBIA3301載體與CRY2B目的片段連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化操作同上述DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，由于載體pCAMBIA3301含有Kan、Amp的特性，所以配制含有Kan、Amp特性的LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化后對含有目的片段的菌液進行PCR檢測，檢測為陽性克隆的菌液，然后進行EcoRI酶切鑒定檢測。如圖4酶切出現(xiàn)一個10 000 bp大小和一個2 000 bp大小的片段條帶。

對酶切鑒定出現(xiàn)正確片段的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果和目的片段序列一致(圖5)，表明pCAMBIA3301-CRY2B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，保存pCAMBIA3301-CRY2B陽性克隆的菌液或提取陽性克隆菌液的質(zhì)粒保存。

圖4 pCAMBIA3301-CRY2B質(zhì)粒酶切鑒定Fig.4 pCAMBIA3301-CRY2B plasmid restrictionenzyme digestion analysis1: pCAMBIA3301-CRY2B 酶切；M: DNA 分子量標記；1 pCAMBIA3301-CRY2B restriction enzymeanalysis; M: DNA ladder

圖5 克隆片段與CRY2B基因片段序列比對Fig.5 Sequence alignment between cloning sequence and CRY2B fragment

2.4 重組質(zhì)粒PCR檢測

將重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-CRY2B導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，在含有50 mg·L-1Kan + 50 mg·L-1rif的YEB培養(yǎng)基上涂板，28℃培養(yǎng)48小時。以菌液為模板，進行PCR擴增，陽性菌落的PCR瓊脂糖凝膠電泳圖如圖6所示。挑選的單菌落都為陽性菌落，表明植物表達載體pCAMBIA3301-CRY2B已轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌GV3101中，可用于后期紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

圖6 pCAMBIA3301-CRY2B質(zhì)粒PCR擴增Fig.6 pCAMBIA3301-CRY2B plasmid PCR amplification1-12 CAMBIA3301-CRY2B PCR擴增；M: DNA 分子量標記；1-12 CAMBIA3301-CRY2B PCR amplification; M: DNA ladder

2.5 酶切鑒定重組質(zhì)粒

利用上述菌液提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，選用pCAMBIA3301載體和CRY2B共有的酶切位點EcoRI，酶切鑒定結(jié)果如圖7所示，酶切出兩條正確的基因片段。

圖7 pCAMBIA3301-CRY2B農(nóng)桿菌質(zhì)粒酶切鑒定Fig.7 pCAMBIA3301-CRY2B Agrobacteriumplasmid restriction enzyme analysis1-2: pCAMBIA3301-CRY2B 酶切；M: DNA 分子量標記1-2：pCAMBIA3301-CRY2B restriction enzyme analysis; M: DNA ladder

2.6 pCAMBIA3301-CRY2B轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)芽的生長

以子葉節(jié)為外植體，適宜的Kan抗性篩選濃度為100 mg·L-1，適宜的子葉節(jié)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA+100 mg·L-1Kan+400 mg·L-1Carb，pCAMBIA3301-CRY2B轉(zhuǎn)基因無菌苗子葉經(jīng)侵染之后，共培養(yǎng)4天，在誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基上進行芽誘導(dǎo)，14～18 d左右子葉長出新芽(圖8)。

圖8 誘導(dǎo)芽的生長Fig.8 The growth of induced shoots

2.7 pCAMBIA3301-CRY2B轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)根的生長

適宜的子葉節(jié)根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2 g·L-1YE+100 mg·L-1Kan+400 mg·L-1Carb。pCAMBIA3301-CRY2B長出新芽的個體移入生根培養(yǎng)基中生長30～40 d，無菌苗苜蓿生根情況如圖9所示。

圖9 pCAMBIA3301-CRY2B轉(zhuǎn)基因植株誘導(dǎo)根的生長Fig.9 The growth of induced roots with transgenic-pCAMBIA3301-CRY2B

2.8 煉苗與再生植株移栽

當再生的芽生長健壯達到約4 cm時，即可轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進行生根誘導(dǎo)。待根部足夠發(fā)達，出現(xiàn)多條根時，開始煉苗。約3～5 d后，小心取出小植株，把根部沖洗干凈，種植到小花盆中。煉苗初期采用透明薄膜罩盆保持較高的濕度，待植株生長穩(wěn)定后，即可摘除，仍保持濕潤環(huán)境，保證幼嫩轉(zhuǎn)基因植株較大的成活率(圖10)。

圖10 煉苗和再生植株移栽Fig.10 Plantlets exercising and transplanting of regenerated plantlets

3 討論與結(jié)論

對擬南芥(Arabidopsisthaliana)的研究發(fā)現(xiàn)，隱花色素和光敏色素具有拮抗和互補的作用[22]，研究表明，光受體基因通過光周期參與了對苜蓿秋眠的調(diào)控[23-27]，在對PHYA、PHYB沉默的轉(zhuǎn)基因植株研究中發(fā)現(xiàn)，CRY2B的表達和PHYB的表達近乎完全一致[23]。秋眠型紫花苜蓿CRY2B在夏季高溫休眠條件下基因表達量沒有發(fā)生變化，但秋眠條件下呈顯著增長[23]，因此在對紫花苜蓿秋眠調(diào)控機制的研究中，CRY2B基因功能的研究至關(guān)重要。

本試驗CRY2B過表達載體構(gòu)建成功后直接轉(zhuǎn)化紫花苜蓿。通過在CRY2B基因的引物兩端加入NcolI的同尾酶BspHI(使用同尾酶可產(chǎn)生相同的粘性末端)和PmlI位點，以提取的苜蓿RNA為模板進行PCR擴增得到CRY2B基因片段。選擇過表達載體上NcolI、PmlI作為雙酶切的酶切位點(載體上沒有BspHI酶切位點)，NcolI酶切(A/CATGT)，為了使氨基酸正確翻譯，CRY2B引物添加NcolI酶切位點時要使用同尾酶BspHI(T/CATGA)。然后將目的片段CRY2B和過表達載體pCAMBIA3301經(jīng)過雙酶切，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因CRY2B的片段插入質(zhì)粒的切口處，首先堿基互補配對結(jié)合，兩個黏性末端吻合在一起，利用NEB公司T4連接酶分別將酶切后基因片段與酶切后pCAMBIA3301質(zhì)粒整合到一起，構(gòu)建pCAMBIA3301-CRY2B重組質(zhì)粒，然后經(jīng)過PCR檢測、堿基序列測序和酶切鑒定確定成功構(gòu)建了pCAMBIA3301-CRY2B過表達載體，植物表達載體pCAMBIA3301-CRY2B已轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌GV3101中，可用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化。

近年來，紫花苜蓿載體構(gòu)建并對煙草進行轉(zhuǎn)化研究較多[28-31]，但轉(zhuǎn)化方式不盡相同。本試驗采用直接分化芽再生途徑轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，以萌發(fā)早期幼苗的子葉節(jié)為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后無需組織培養(yǎng)，外植體細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織的階段，而是直接分化出不定芽，進而生長發(fā)育為完整植株。該途徑的優(yōu)點是：植株再生周期短，遺傳變異較小，轉(zhuǎn)入的外源基因遺傳穩(wěn)定性高。鄭寶仁等[32]以子葉節(jié)為外植體，在MS培養(yǎng)基上添加不同的激素組合直接進行不定芽的誘導(dǎo)，最終得到離體再生植株。Kumar等[33]研究發(fā)現(xiàn)對莖尖外植體可以直接進行不定芽的誘導(dǎo)(最多時一個外植體可以誘導(dǎo)出35個不定芽)，然后再加入適當比例的NAA和活性炭即可誘導(dǎo)生根進而得到完整植株，并且該流程能夠適用于5個印度苜蓿品種。本試驗以紫花苜蓿子葉節(jié)為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCAMBIA3301-CRY2B成功轉(zhuǎn)化苜蓿植株，為進一步研究CRY2B調(diào)控苜蓿秋眠性分子機制奠定基礎(chǔ)。