趙雅姣， 田新會， 杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/ 甘肅省草業(yè)工程實驗室/ 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展中心， 甘肅 蘭州730070)

目前用于分析植物遺傳多樣性的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR等[1]，其中ISSR(Inter-simple sequence repeat)具有快速、高效、靈敏、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，在種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[2]。ISSR是以微衛(wèi)星序列作為引物而進行PCR擴增的DNA分子標(biāo)記[3]，遵從孟德爾遺傳規(guī)律，是一種顯性標(biāo)記[4]。ISSR無需知道DNA模板序列，可對模板中不同大小且分散在整個基因組中的DNA序列進行擴增，其標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于包括狗牙根(Cynodon)[5]、早熟禾(PoaannuaL.)[6]和燕麥(Avena)[7]等飼草作物上。

小黑麥(Triticale)是小麥(Triticum)和黑麥(Secale)的多倍體雜種，于1970年首先在加拿大育成。在隨后幾十年的發(fā)展中，全世界育種工作者共培育了500多個品系，廣泛適應(yīng)于不同栽培氣候條件[8]。飼草型小黑麥的草產(chǎn)量均高于小麥和燕麥，其粗蛋白及糖分含量也明顯高于小麥和燕麥[9]，我國部分地區(qū)種植的超高稈飼草型小黑麥在產(chǎn)量及營養(yǎng)價值上具有其他飼草作物不可替代的優(yōu)點，對家畜生產(chǎn)具有重要意義[10]。目前，飼草型小黑麥在我國西南、西北等高寒山區(qū)均有種植，表現(xiàn)出抗逆性強、生長繁茂、生物量高、品質(zhì)好等優(yōu)點[11]。小黑麥的選育初衷是發(fā)展優(yōu)質(zhì)牧草，但其籽粒營養(yǎng)豐富、品質(zhì)優(yōu)異，因而成為糧飼兼用型作物，具有很大發(fā)展前途[12]。在小黑麥育種中大多使用相同的骨干親本，致使小黑麥的多樣性降低，遺傳基礎(chǔ)變窄，制約草產(chǎn)量和品質(zhì)的進一步提高[13]。引進不同地區(qū)的優(yōu)異種質(zhì)資源是增加小黑麥遺傳多樣性的有效途徑，同時也可深入進行小黑麥種質(zhì)系統(tǒng)研究，為小黑麥遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

不同小黑麥種質(zhì)在形態(tài)特征上差異較小，在常規(guī)選育及種內(nèi)或種間雜交時，需花費大量時間篩選出優(yōu)良表現(xiàn)型，而表現(xiàn)型受環(huán)境影響較大。分子標(biāo)記既可以了解小黑麥的遺傳背景信息，還可以深入了解其遺傳多樣性，并且耗時少，可靠性高。目前，國外對小黑麥遺傳多樣性方面的研究較多，Tams等[14]利用SSR標(biāo)記研究了歐洲冬性小黑麥的遺傳多樣性，Katharina等[15]利用DArT標(biāo)記比較了冬性和春性小黑麥的多樣性和連鎖不平衡性，Mikhailova等[16]分析了小黑麥抗葉銹病多樣性的田間表現(xiàn)，Orlovskaya等[17]利用RAPD和ISSR標(biāo)記研究了俄羅斯春性小黑麥的遺傳多樣性。國內(nèi)對小黑麥的研究主要集中在草產(chǎn)量[18]及品質(zhì)[19]、最佳刈割期[20]及施肥[21]、抗性[22]及適應(yīng)性[23]等方面，基于ISSR分子標(biāo)記的小黑麥遺傳多樣性報道僅有1篇[24]，而且有致命缺點，即每個小黑麥材料的擴增條帶為兩條，其中1條為引物二聚體，無多態(tài)性，不能作為小黑麥ISSR-PCR反應(yīng)體系，沒有參考價值。本研究擬利用ISSR分子標(biāo)記，對來自澳大利亞和國內(nèi)不同區(qū)域30份飼草型小黑麥種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，以研究不同種質(zhì)間的遺傳差異及遺傳背景，為小黑麥育種及ISSR分子輔助育種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試材料為從澳大利亞悉尼大學(xué)和國內(nèi)黑龍江、河北、北京、內(nèi)蒙、新疆等地引進的產(chǎn)量性狀較好的飼草型小黑麥種質(zhì)。小黑麥種質(zhì)及來源見表1(材料來源地即其育成地)。其中，33RD ITSN，CHEROKEE，新小黑麥4號，新小黑麥5號，北聯(lián)1號，北聯(lián)4號，北聯(lián)5號，中拉一號為小黑麥品種，其余為小黑麥品系。所有材料均屬于冬性。

表1 供試小黑麥種質(zhì)及其來源Table 1 Name list and origin of Triticale genotypes

1.2 DNA提取

30份小黑麥種質(zhì)待長至2～3葉時取樣。取樣時從每份種質(zhì)中剪取8～10片幼嫩葉片，用錫箔紙包裹并置于-80℃冰箱保存。采用改良的CTAB法[25]提取基因組DNA，溶于50 μL TE中備用。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對降解程度進行檢測，使用超微量紫外分光光度計對DNA濃度和純度進行檢測，并調(diào)整DNA濃度至20～30 ng·μL-1，-20℃保存

1.3 引物及PCR擴增

采用粗略調(diào)整的小麥屬植物的反應(yīng)體系及PCR擴增[25]對小黑麥引物進行篩選，參考適于禾本科植物ISSR-PCR反應(yīng)體系[26-27]，從中選取30條引物，進行PCR擴增，并參照引物Tm值，設(shè)定退火溫度為：49，49.6，50.7，52.3，54.4，56.2，57.3，58℃，從中篩選出每個引物的最佳退火溫度[28]。

反應(yīng)體系采用正交設(shè)計與單因素試驗相結(jié)合的方法。正交試驗設(shè)計為L16(45)，對Mg2+濃度、dNTPs濃度、引物濃度和Taq DNA酶濃度進行4因素4水平試驗。根據(jù)正交試驗結(jié)果，選出擴增效果最佳的體系，在此基礎(chǔ)上再對每一單因素進行細(xì)化及梯度優(yōu)化，最終確定其最佳反應(yīng)體系(20 μL)為：1.9 mmol·L-1Mg2+，0.2 mmol·L-1dNTPs，0.65 μmol·L-1引物，2 U Taq DNA聚合酶，PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52.3℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃再延伸7 min[28]。1.5%瓊脂糖對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠檢測，DM2000作標(biāo)準(zhǔn)分子量對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對各引物的ISSR擴增圖譜進行人工讀帶，根據(jù)分子標(biāo)記在相同電泳遷移率(相同分子量片段)，將電泳圖譜中同一位置上的條帶有無進行統(tǒng)計，相同遷移位置的DNA帶賦值為“1”，不存在的賦值為“0”。不同遷移位置的條帶總數(shù)為擴增總條帶數(shù)，每個種質(zhì)均出現(xiàn)的條帶位點數(shù)為共有條帶數(shù)，多態(tài)性比率=(總條帶數(shù)-共有條帶數(shù))/總條帶數(shù)×100%。

利用POPGENE32[29]計算遺傳相似性系數(shù)(GS)、遺傳距離(GD=1-GS)、計算多態(tài)性比率(PPB)，生成0/1原始數(shù)據(jù)矩陣，并建立原始數(shù)據(jù)表。采用UPGMA法(unweighted pair-group method arithmetic averages，非加權(quán)配對算術(shù)平均法)進行居群間Nei遺傳距離的聚類分析，并做出遺傳相似系數(shù)聚類圖，使用軟件為NTSYS-PC(Version 2.10e)[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測

30份小黑麥種質(zhì)提取DNA后的檢測結(jié)果如圖1所示。基因組DNA加樣孔清晰，條帶整齊，無拖尾，表明基因組DNA樣品較純，基本無降解、無多糖、無多酚等雜質(zhì)及無RNA污染。超微量紫外光分光光度計測定其OD260/OD280為1.7～1.9，OD260/OD230為2左右，符合PCR要求。

圖1 小黑麥DNA電泳結(jié)果
Fig.1 Electrophoresis result of DNA on triticale

2.2 多態(tài)性分析

本研究在前期研究[28]基礎(chǔ)上，最終篩選出12條穩(wěn)定性及重復(fù)性好、多態(tài)性高且條帶清晰的引物，用于30份小黑麥種質(zhì)的擴增，各引物最佳退火溫度及擴增結(jié)果如表2所示。12條引物在小黑麥ISSR-PCR擴增中共檢測到124條擴增條帶(位點)，不同引物擴增條帶數(shù)不同，最少可擴增出7條(UBC857)，最多可擴增出15條(UBC815)，其中多態(tài)性條帶共96條，平均每個引物擴增出8條多態(tài)性條帶。多態(tài)性比率(PPB)的平均值為77.42%，其中UBC808與UBC815多態(tài)性最好，PPB值為100%。UBC807與UBC847圖譜最清晰，擴增效果最好，且擴增條帶數(shù)豐富，均為13條，片段大小為250～2 000 bp(圖2)。說明30份小黑麥種質(zhì)的多態(tài)性好，遺傳變異大，能夠有效揭示小黑麥種質(zhì)的多態(tài)性。

表2 小黑麥ISSR分析所用引物序列和擴增結(jié)果Table 2 Primer sequences and amplified results for ISSR analysis of triticale

圖2 引物UBC807(a)和UBC847(b)對30份小黑麥種質(zhì)DNA的ISSR擴增圖譜
Fig.2 ISSR fingerprints for the DNA samples of 30 triticale genotypes amplified by the primer UBC 807(a) and UBC 847(b)
注：M表示分子量標(biāo)記；種質(zhì)編號同表1
Note: M means the marker. The genotype number is the same as showed in the table 1.

2.3 遺傳相似性分析

應(yīng)用NTSYS2.1軟件，以30個小黑麥種質(zhì)和124條擴增條帶數(shù)據(jù)為原始矩陣，共獲得450個兩兩不同種質(zhì)間的Dice相似系數(shù)(表3)。由表3可知，遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.66～0.91之間，平均遺傳系數(shù)為0.77，說明30份小黑麥種質(zhì)遺傳相似系數(shù)較小，各種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其中OH2236(29)與OH2473(30)的遺傳相似性系數(shù)最大(0.91)，表明他們之間親緣關(guān)系最近，種質(zhì)來源或雜交親本可能相同；安83-25(21)與北聯(lián)3號(14)的遺傳相似系數(shù)最小(0.66)，表明他們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異最大，存在較高的遺傳多樣性。遺傳相似性分析可知，供試各種質(zhì)間普遍存在較大的差異性。

表3 30份小黑麥種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)矩陣Table 3 Genetic similarity matrix basic on ISSR polymorphism for 30 Triticale genotypes

2.4 聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)，用NTSYSpc2.10e軟件對30份小黑麥種質(zhì)進行聚類分析，獲得聚類圖(圖3)。在GS=0.765處可把30份小黑麥種質(zhì)分為6類，第Ⅲ類為8809(5)；第Ⅵ類為81S37(9)；第Ⅴ類為826126(8)和北聯(lián)3號(14)，遺傳相似系數(shù)為0.83；第Ⅰ類為33RD ITSN (1)、CHEROKEE(2)和新麥5號(4)，其中33RD ITSN 與新麥5號的遺傳相似系數(shù)較近，為0.85；第Ⅳ為北聯(lián)4號(15)、PH389(19)、DH796(20)、安83-25(21)、中拉一號(22)，其中北聯(lián)4號與安83-25、PH389與中拉一號的親緣關(guān)系較近；其余種質(zhì)為第Ⅱ類，其遺傳相似系數(shù)為0.77～0.91，其中OH2236(29)與OH2473(30)的GS=0.91，HH124(17)與HH127(18)的GS=0.90，OH1859(26)與OH1181(28)的GS=0.87，84B-141(12)與北聯(lián)5號(16)的GS=0.87，以上種質(zhì)的親緣關(guān)系較近。

圖3 30份小黑麥種質(zhì)的聚類樹狀圖
Fig.3 The cluster tree for the 30 Triticale genotypes

3 討論

3.1 小黑麥遺傳多樣性的ISSR分析

甘肅省定西地區(qū)位于黃土高原的黃土丘陵溝壑區(qū)，環(huán)境惡略，降水稀少，土地稀薄，適宜該區(qū)種植的谷類作物極少且效益低[31]。小黑麥具有抗病、抗逆性強，耐酸堿，適應(yīng)性廣，生物量及種子產(chǎn)量高，營養(yǎng)品質(zhì)好，相對節(jié)水，省肥等優(yōu)點，適應(yīng)定西地區(qū)種植。由于小黑麥?zhǔn)侨斯るs交種且發(fā)展僅幾十年，所以育成的小黑麥品種較少且遺傳性狀較為相似，因此，利用分子標(biāo)記對小黑麥的遺傳基因進行分析，探討親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及其遺傳多樣性，對小黑麥選育及品種改良具有重要意義。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析研究，并取得了較好效果。ISSR分子標(biāo)記具有較豐富的多態(tài)性，可檢測到植物基因組中的微小變異，將親緣關(guān)系較近的材料區(qū)分開。在引物篩選中，尚海英等[32]在黑麥草屬的35條引物中篩選出可擴增出譜帶清晰的7條引物，占20%；杭焱等[33]從華山新麥草(HuaShanWildrye)的100條引物中篩選出12條，占12%；劉麗等[34]從野牛草(Buchloedactyloides)的50條引物中篩選出7條，占17%。本研究在30個引物中篩選出了12條較好的引物，占40%，說明ISSR分子標(biāo)記對小黑麥具有較好的穩(wěn)定性，且多態(tài)性高。

本試驗利用ISSR分子標(biāo)記對30份小黑麥種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，通過PCR擴增得到多態(tài)性差異及遺傳相似系數(shù)，可反映出不同種質(zhì)間的遺傳距離及關(guān)系，可為選育小黑麥新品種選擇親本提供參照依據(jù)，并對雜交后代的雜種優(yōu)勢進行估測，提高育種效率。不同基因組DNA的多態(tài)性表現(xiàn)不同，采用ISSR分子標(biāo)記時，三角葉黃連(Coptisdeltoidea)多態(tài)位點為73.44%[35]，紫茉莉(MirabilisjalapaL.)為92.54%[36]，新麥草(Psathyrostachysjuncea(Fisch.) Nevski)為85.70%[37]，小蒼蘭(FreesiarefractaKlatt)為64.62%[38]，鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為55.92%[39]。本試驗利用12個引物對30份小黑麥種質(zhì)擴增，獲得124條譜帶，其中77.42%的擴增片段能夠揭示出親本間的遺傳差異，表明小黑麥親本間的遺傳多樣性處于中等水平，且具有較豐富的遺傳基礎(chǔ)。

30份小黑麥種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.66～0.91，遺傳相似系數(shù)跨幅較大，遺傳多樣性較高，主要是因為：首先30份小黑麥種質(zhì)來自不同地區(qū)，其生長環(huán)境、親本材料及培育過程不同，導(dǎo)致形成不同生態(tài)類型；其次，能夠申報為品種的小黑麥種質(zhì)均具有遺傳豐富的特點。第Ⅳ類與第Ⅴ類的遺傳相似系數(shù)最小，說明該兩類種質(zhì)的遺傳多樣性較大，其中安83-25與北聯(lián)3號的遺傳相似系數(shù)為0.66，具有較大的遺傳距離，另外，安83-25與北聯(lián)3號小黑麥種質(zhì)均適應(yīng)甘肅省定西地區(qū)的氣候條件，草產(chǎn)量較高，草品質(zhì)較好，因此可將兩者作為親本材料進行雜交，以選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小黑麥新品種，其后代將具有較強的雜種優(yōu)勢。8809為第Ⅵ類，該種質(zhì)與其他種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)均小于0.81，說明該種質(zhì)具有較大的遺傳差異性，在雜交育種中具有重要地位。81S28與83P-91、826126、81S37均來自內(nèi)蒙古農(nóng)科院，其中81S37與其他3個種質(zhì)的遺傳距離較大且不屬于同一類，其原因可能是基因突變，在進化過程中個別基因發(fā)生變異，且變異后仍較好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境并使其基因型保存下來；由于串粉而導(dǎo)致天然雜交；81S37與81S28、83P-91、826126本身的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.2 小黑麥種質(zhì)的遺傳多樣性與地理來源

本試驗的供試材料來源于澳大利亞和黑龍江、河北、北京、內(nèi)蒙、新疆等地，這些小黑麥種質(zhì)的遺傳多樣性較為豐富，遺傳背景差異相對顯著，但相同地區(qū)的部分種質(zhì)可能由于種源地所處的環(huán)境相同，父母本相似，或引種馴化及人工選育方法相同，以及種質(zhì)間的不斷雜交而表現(xiàn)出親緣關(guān)系較近的現(xiàn)象，因此聚為一類，如第Ⅱ類的18份種質(zhì)中，來自中國農(nóng)科院作物所的“OH”系列全部屬于其中，說明“OH”系列小黑麥種質(zhì)的父母本親緣關(guān)系極為相似，其中OH2236與OH2473的遺傳相似系數(shù)為0.91。第Ⅰ類中的33RD ITSN與CHEROKEE均來自澳大利亞悉尼大學(xué)，其遺傳相似性系數(shù)為0.82，推測2種質(zhì)可能具有相同的父母本，這與劉永財?shù)萚37]與范彥等[40]新麥草和扁穗牛鞭(Hemarthriacompressa)草種質(zhì)遺傳多樣性的研究結(jié)果一致。北聯(lián)4號與北聯(lián)3號、中拉一號與OH1194等均來源于同一地區(qū)，但遺傳相似性較小，GS值分別為0.76和0.72，說明遺傳聚類與地理來源沒有嚴(yán)格的一致性，這與周少云等[41]的研究結(jié)果一致。

3.3 綜合分析

利用ISSR分子標(biāo)記可獲得清晰且多態(tài)性高的小黑麥電泳圖譜，且比其他分子標(biāo)記容易操作、節(jié)省時間、花費小，應(yīng)用于小黑麥遺傳多樣性研究及不同濃度DNA水平識別較可靠。另外，小黑麥?zhǔn)亲曰ㄊ诜壑参?，利用ISSR分子標(biāo)記分析的準(zhǔn)確性明顯高于異花授粉植物[42]。在小黑麥雜交育種中，應(yīng)盡可能選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、性狀較好的材料作為親本，以提高雜交后代的雜種優(yōu)勢。

4 結(jié)論

參試飼草型小黑麥種質(zhì)遺傳多樣性較豐富，利用ISSR的12條引物共檢測到124條擴增條帶(位點)，平均多態(tài)性比率(PPB)為77.42%。30份種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)(GS)為0.66～0.91。在GS=0.765處將30份小黑麥種質(zhì)分為6類，其中8809及81S37與其他種質(zhì)的遺傳距離最大，單獨聚為一類；826126和北聯(lián)3號為第Ⅴ類；33RD ITSN 、CHEROKEE和新麥5號為第Ⅰ類；北聯(lián)4號、PH389、DH796、中拉一號和安83-25為第Ⅳ類；其余種質(zhì)聚為第Ⅱ類。第Ⅳ類與第Ⅴ類的小黑麥種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)均較小，安83-25和北聯(lián)3號可以進行雜交，以選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小黑麥新品種。