何文平， 楊鵬軍， 張旭強， 王新霞， 仇奕之， 林美貞， 楊 寧

(西北師范大學生命科學學院， 甘肅 蘭州730070)

植物生長受多種調(diào)控因子的影響，而溫度是這些調(diào)控因子中一個重要因素，溫度的變化直接影響植物的生長發(fā)育?；钚匝?Reactive oxygen ROS)是植物有氧代謝的產(chǎn)物，在植物很多生理過程中均發(fā)揮作用。植物在正常條件下能產(chǎn)生ROS[1]，此時 ROS的產(chǎn)生與清除處于一個動態(tài)平衡過程中。環(huán)境脅迫引發(fā)ROS的產(chǎn)生并過度積累[2]。早在1998年時，Rauen等[3]發(fā)現(xiàn)冷脅迫能引發(fā)肝癌細胞ROS的釋放[3]； 1994年P(guān)rasad[4]發(fā)現(xiàn)在玉米幼苗中低溫能夠引發(fā)ROS的大量產(chǎn)生。之后類似的研究越來越多。積累的ROS會損傷膜脂流動性,擾亂細胞的正常代謝[5]，在這個過程中因膜磷脂過氧化引起的膜損傷是ROS對植物傷害的事件之一。另外細胞和細胞器膜脂質(zhì)過氧化后會直接影響細胞功能并加重氧化脅迫[6]，結(jié)果是膜磷脂被過氧化并且降低了膜的流動性，在磷脂雙分子層中磷脂代謝的速率加快，同時也增加了膜對底物的滲透率[7]。

PLD在植物中普遍存在，其活性直接影響膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性[8]。PLD對于膜的影響相當顯著，嚴重時能導致膜的功能和完整性喪失[9]。除此之外，PLD可根據(jù)刺激強度傳遞膜重建和降解的信號[10]，例如在干旱脅迫早期階段PLD轉(zhuǎn)導促進氣孔關(guān)閉的信號，而延長干旱脅迫后，PLD卻加速膜降解[11]。

有關(guān)ROS和PLD之間的相互作用的研究已有很多，例如在擬南芥中PLD參與ROS的產(chǎn)生并且增加NADPH氧化酶的活性[12]；在水稻細胞中，H2O2誘導PLD活性是水稻細胞抗毒素生物合成的必須過程[13]；在擬南芥中，H2O2誘導PLD降低了ROS誘導的細胞凋亡等[14]。這些研究說明ROS與PLD之間存在著一定的作用關(guān)系，然而是通過怎樣的機制來維持兩者的相互作用目前還無明確報道。

基于此，我們以高山離子芥(chorisporabungeana)作為試驗材料，以低溫(4℃，0℃和-4℃)作為脅迫因子，研究低溫引發(fā)的內(nèi)源性ROS對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控作用，以期進一步揭示ROS對PLD活性的調(diào)控機制。

1 試驗材料

1.1 試管苗的培養(yǎng)

高山離子芥試管苗的培養(yǎng)根據(jù)楊寧等的方法[15]。種子去皮并用70%乙醇浸泡，再用0.1%升汞浸泡5～8 min，無菌水沖洗3次，種子直接接種于MS培養(yǎng)基中(不含任何激素)并置于光照培養(yǎng)架上(25℃，2 000 lx，12 h光照)培養(yǎng)。待種子萌發(fā)長至一定高度后將試管苗接種于MS培養(yǎng)基(MS+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7.8 g·L-1瓊脂，pH 5.8，溫度25℃，光照周期為12 h)中培養(yǎng)15 d，然后用于試驗。

1.2 材料的處理

H2O2處理：將1，5和10 mmol·L-1H2O2分別添加于MS培養(yǎng)基中，然后將生長旺盛的高山離子芥接種于該培養(yǎng)基中并外施上述濃度的H2O2于葉上；EGTA處理：將5 mmol·L-1EGTA添加于MS培養(yǎng)基中；CaCl2處理：將 10 mmol·L-1CaCl2添加于MS培養(yǎng)基中；DPI處理：將12.5 μmol·L-1的DPI添加于MS培養(yǎng)基中；DPI+ CaCl2處理：將12.5 μmol·L-1DPI和10 mmol·L-1CaCl2添加于MS培養(yǎng)基中，然后將生長旺盛的高山離子芥接種于上述培養(yǎng)基中，以上處理的材料(不同濃度H2O2處理組正常培養(yǎng))均置于人工培養(yǎng)箱中，分別在4℃，0℃和-4℃中低溫培養(yǎng)6～72 h。試驗設(shè)置0 h作為對照組。

2 試驗方法

2.1 高山離子芥磷脂酶D的制備

磷脂酶D的制備根據(jù)Mao等的方法并略作改變[16]。取0.5 g高山離子芥置于預冷的研缽中研磨，以研缽10 mmol·L-1pH 7.0 的HEPES 為提取緩沖液，研制成10%的勻漿然后將勻漿轉(zhuǎn)入到離心管中于高速臺式離心機(Beckman，型號:Allegram64R)以1 000 g(Rotor：F1010)離心15 min去掉碎片。上清液以15 000 g(Rotor：F1010)的離心力離心60 min得到線粒體膜蛋白，所得到的這些蛋白融于100 mmol·L-1pH 6.5的DMG中，此時的溶液為線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD酶液。

2.2 磷脂酶D活性的測定

磷脂酶D活性的測定用酶聯(lián)免疫法[17]，在離心管中配制200 μL的反應體系，其中100 mmol·L-1DMG(pH 6.5)，10 mmol·L-1MgCl2， 0.1 mmol·L-1CaCl2， 5 mmol·L-1亞油酸，20 μL酶液以及12 mmol·L-1PC(最后加入)。反應體系于30℃水浴中反應30 min，然后在沸水浴終中中止反應15 min。冷卻后加入顯色液800 μL，在30℃水浴中反應60 min，待顏色穩(wěn)定后加入脫蛋白液，搖勻，用0.22 μm孔徑的濾膜濾去雜蛋白，最后于紫外可見分光光度計(Agilent，型號：G1115A)中500 nm處測OD值。

2.3 線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的測定

線粒體膜的提取方法同2.1。膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的測定根據(jù)趙宇瑛的方法并略作修改[18]，得到的線粒體膜沉淀用懸浮液(0.125 mol·L-1蔗糖，1 mmol·L-1Tris-Mes(pH7.2)，6 mmol·L-1β-巰基乙醇)懸浮，隨后加入HCl使其終濃度為0.2 mol·L-1。將混合液震蕩搖勻后，在15 000 g的作用下離心30 min，所得的上清液用原子吸收分光光度儀檢測Ca2+含量。

2.4 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定采用Prochazkova D的方法略作修改[19]，稱取0.2 g高山離子芥葉，添加2 mL0.1%預冷的三氯乙酸研磨成原漿，在12 000 g離心力下離心20 min，然后將上清液1 mL與等體積的磷酸緩沖液(10 mmol·L-1，pH 7.0)及1 mol·L-1KI混勻，于390 nm測吸光值，結(jié)果以μmol·L-1(FW)表示。

2.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0對組內(nèi)隨時間變化的差異性進行多重比較,采用LSD法分析，利用origin pro9.0軟件作圖。

3 結(jié)果分析

3.1 H2O2對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的的影響

為了說明H2O2對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性產(chǎn)生的影響，在正常培養(yǎng)條件下用不同濃度H2O2處理高山離子芥，結(jié)果如圖1所示。3個濃度H2O2處理后，PLD活性均表現(xiàn)出較對照組升高，但各濃度H2O2處理下PLD活性在0～72 h過程中變化規(guī)律不一致。H2O2對PLD活性的影響在0～72 h的過程中表現(xiàn)出低濃度H2O2對PLD活性的誘導作用高于高濃度；并且在72 h時，3個濃度處理下PLD活性均達到最大值，分別高出對照組290.0%，163.4%和102.7%。

3.2 低溫脅迫對高山離子芥葉中H2O2含量的影響

在4℃，0℃和-4℃條件下處理高山離子芥72 h后，其葉中H2O2含量如圖2所示。在3個溫度脅迫下H2O2含量在0～6 h過程中增加隨后在0℃和-4℃處理組中H2O2含量降低直到72 h。而在4℃的處理組中H2O2含量持續(xù)增加直到72 h且在該溫度下72 h時H2O2含量達到最大值，此時H2O2含量較空白對照組上升了134.4%。在0℃和-4℃條件下處理6 h時兩者H2O2含量達到最大值，且分別較空白對照組上升了112.4%和184.2%。在整個脅迫過程中，3個溫度處理下H2O2含量均高于對照組。

圖1 H2O2對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.1 The effect of H2O2on the activity of mitochondrial membrane bound-PLD in chorispora bungeana leaves
注:圖中不同的小寫字母表示同一濃度處理不同時間上差異顯著(P<0.05)；不同的大寫字母表示同一處理時間不同濃度上差異顯著(P<0.05)，下同
Note: Different lowercase letters indicate significant difference at different treatment time of the same concentration， different uppercase letters indicate significant difference under different concentration at the same treatment time at the 0.05 level. The same below

圖2 低溫脅迫下高山離子芥葉中H2O2含量的變化
Fig.2 The change of H2O2content in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.3 低溫脅迫對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4℃，0℃和-4℃條件下處理高山離子芥72 h后葉,中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖3所示。在3個溫度作用下PLD活性均表現(xiàn)出較空白對照組升高，在4℃脅迫下PLD活性持續(xù)增加；在0℃和-4℃脅迫下PLD活性在0～6 h過程中增加隨后降低。在4℃脅迫下72 h時PLD活性達到最大值，此時相對于空白對照組上升190.6%。在0℃和-4℃處理組中6 h時PLD活性達到最大值，此時相對于空白對照組分別上升了182.5%和145.4%。

圖3 低溫脅迫下高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的變化
Fig.3 The change of mitochondrial membrane bound phospholipase D in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.4 低溫脅迫下DPI處理對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

DPI是NADPH氧化酶的抑制劑。在4℃，0℃和-4℃脅迫下，添加12.5 μmol·L-1DPI處理高山離子芥后線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖4所示。在4℃脅迫下，對照組中PLD活性持續(xù)增加，到72 h時PLD活性達到最大值，此時較空白對照組PLD活性上升了190.6%。添加DPI處理后在6～72 h過程中，PLD活性均較對照組降低。在24 h時添加DPI處理的PLD活性與其他時間點相比較對照組PLD活性下降最低，此時較對照組PLD下降17.4%。在0℃和-4℃脅迫下對照組中PLD活性在0～6 h過程中升高，在6 h時兩者PLD活性均達到最大值，與空白對照組相比分別升高了196.5%和145.4%。添加DPI處理后在6～72 h過程中，PLD活性較對照組中PLD活性低。在0℃和-4℃脅迫下72 h時添加DPI處理的PLD活性與其他時間點相比較對照組PLD活性下降最低，此時相對于對照組PLD活性分別下降15.1%和21.0%。

圖4 低溫脅迫下DPI對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.4 The effect of DPI on the activity of mitochondrial membrane bound PLD in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.5 低溫脅迫下DPI處理對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的影響

在4℃，0℃和-4℃脅迫下，添加12.5 μmol·L-1DPI處理高山離子芥后線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量變化如圖5所示。在4℃脅迫下對照組中線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量持續(xù)降低，到72 h時Ca2+含量達到最低值，此時與空白對照組相比Ca2+含量下降了77%。添加DPI處理后在6～72 h過程中，線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量較對照組中Ca2+含量升高。在6 h時DPI處理組中Ca2+含量與其他時間點相比較對照組中Ca2+含量升高最低，此時相對于對照組中Ca2+含量升高23.07%。在0℃和-4℃條件下對照組中Ca2+含量在0～6 h過程中降低隨后升高，在6 h時兩者Ca2+含量均達到最低值，與空白對照組相比分別降低了49.9%和33.1%。添加DPI處理后在6～72 h過程中，Ca2+含量較對照組中Ca2+含量升高。在0℃和-4℃脅迫下72 h時DPI處理組中Ca2+含量與其他時間點相比較對照組中Ca2+含量升高最低，此時相對于對照組中Ca2+含量升高18.4%和8.7%。

圖5 低溫脅迫下DPI對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量的影響
Fig.5 The effect of DPI on the activity of mitochondrial membrane boundCa2+content in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.6 低溫脅迫下DPI+CaCl2處理對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4℃，0℃和-4℃脅迫下添加12.5 μmol·L-1DPI+10 mmol·L-1CaCl2處理高山離子芥后， 線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖6所示。在4℃條件下DPI處理組中，PLD活性在6～72 h過程中持續(xù)增加，到72 h時PLD活性達到最大值，此時與0 h 處理組相比活性上升了125.2%；添加CaCl2處理后在6～72 h過程中PLD活性均較DPI處理組增加且在6 h時PLD活性相對于DPI處理組中PLD活性上升最低，此時與DPI處理組中PLD活性相比上升14.2%。在0℃和-4℃脅迫下0～6 h過程中DPI處理組PLD活性增加；在6 h時PLD活性達到最大值分別高出空白對照組98.9%和36.9%。添加CaCl2處理后兩者在6～72 h過程中PLD活性均增加且均高于DPI處理組中PLD活性。

圖6 低溫脅迫下DPI+CaCl2對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.6 The effect of DPI+CaCl2on the activity of mitochondrial membrane bound-PLD in leaves of chorispora bungeana under low temperature

3.7 低溫脅迫下EGTA處理對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響

在4℃，0℃和-4℃脅迫下用5 mmol·L-1EGTA處理高山離子芥后線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性變化如圖7所示。在4℃脅迫下對照組中 PLD活性持續(xù)增加且在72 h時活性達到最大值，此時相對于空白對照組PLD活性上升了335.7%。添加EGTA處理后PLD活性較對照組PLD活性在6～72 h過程中降低且在48 h時EGTA處理組中PLD活性與其他時間點相比下降最小，此時相對于對照組PLD活性下降了28.4%。在0℃脅迫下對照組PLD活性在0～6 h過程中增加隨后降低，在6 h時活性達到了最大值，與空白對照組相比PLD活性上升了72.5%。加入EGTA處理后在6～72 h過程中，PLD活性均低于對照組且在72 h時EGTA處理組中PLD活性與其他時間點相比下降最小，此時相對于對照組PLD下降了18.2%。在-4℃脅迫下對照組中PLD活性在0～24 h過程中持續(xù)增加隨后降低，在24 h時PLD活性達到最大值，此時與對照組相比上升了156.5%。加入EGTA處理后在6～72 h過程中PLD活性均低于對照組，且在6 h時EGTA處理組中PLD活性與其他時間點相比下降最小，此時相對于對照組PLD下降了19.8%。

圖7 低溫脅迫下EGTA對高山離子芥葉中線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的影響
Fig.7 The effect of EGTA on the mitochondrial membrane bound-PLD in leaves of chorispora bungeana under low temperature

4 討論與結(jié)論

有研究發(fā)現(xiàn)ROS對Ca2+有調(diào)控作用，例如動物中ROS能增加神經(jīng)細胞胞漿中Ca2+含量[25]，氧化脅迫能誘導胞內(nèi)Ca2+含量上升[26]并且對質(zhì)膜Ca2+通道也發(fā)揮著重要作用[27]。H2O2能激活多種Ca2+通道并促使胞內(nèi)Ca2+水平升高[28]；有學者認為ROS是Ca2+信號轉(zhuǎn)導的上游調(diào)節(jié)因子[29]。在本研究中，當用DPI處理高山離子芥后，其線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量高于對照組(圖5)，表明ROS促進了線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+的釋放。PLD活性受Ca2+調(diào)控，但是調(diào)控PLD活性的Ca2+往往只需要微量級[30]。當添加DPI后，PLD活性低于對照組(圖4)，而該條件下線粒體膜結(jié)合態(tài)Ca2+含量卻高于對照組(圖5)，說明ROS對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控是通過鈣離子介導。趙宇瑛在研究機械損傷對黃瓜的作用時得到類似的結(jié)論[18]。本研究中DPI+CaCl2處理高山離子芥后，PLD活性高于DPI處理組(圖6)，并且當用Ca2+螯合劑EGTA處理高山離子芥后，其PLD活性又降低(圖7)，這就進一步說明ROS對PLD活性的調(diào)控與Ca2+有關(guān)。但是由于胞質(zhì)Ca2+的來源復雜，難確定低溫脅迫下哪些途徑的Ca2+參與了ROS對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性的調(diào)控。因此在后續(xù)研究Ca2+參與的信號轉(zhuǎn)導事件中弄清楚Ca2+的來源更有助于研究植物細胞中Ca2+參與的信號轉(zhuǎn)導機制。

以上結(jié)果表明在高山離子芥葉中低溫脅迫引發(fā)的內(nèi)源性ROS通過Ca2+對線粒體膜結(jié)合態(tài)PLD活性進行調(diào)控。