許冬梅， 張 萍， 柯文燦， 郭旭生

(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅 蘭州 730000)

青貯飼料是用新鮮的青綠飼草在厭氧條件下由乳酸菌經(jīng)較長時(shí)間發(fā)酵制成的一種顏色黃綠、氣味酸香、柔軟多汁、適口性好、消化率較高的飼料，其能為反芻動(dòng)物在冬春季提供優(yōu)質(zhì)的粗飼料[1]。微生物在青貯發(fā)酵過程中起到至關(guān)重要的作用，參與青貯過程的微生物種類很多，青貯原料上附著的微生物包括有利于青貯飼料發(fā)酵的微生物以及引起青貯腐敗變質(zhì)的微生物等，主要有醋酸菌、梭菌、腐敗菌、霉菌、酵母菌和乳酸菌等。乳酸菌是青貯發(fā)酵過程中起主要作用的微生物[2]，他不僅可以利用原料的可溶性糖發(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸尤其是乳酸，降低pH值，還可以通過競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì)及產(chǎn)生細(xì)菌素等代謝物質(zhì)抑制青貯有害菌[3]。但乳酸菌在牧草表面附著的數(shù)量遠(yuǎn)小于好氧細(xì)菌[4]。牧草附著的乳酸菌在自然青貯中起重要作用，其數(shù)量和組成是決定是否需要接種外源乳酸菌來促進(jìn)青貯發(fā)酵的關(guān)鍵因素[5]。就飼料青貯而言，一個(gè)良好的微生物發(fā)酵過程是將飼草調(diào)制成高品質(zhì)青貯飼料的關(guān)鍵。而青貯飼料發(fā)酵過程的微生態(tài)調(diào)控是一個(gè)難度大但又具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值和實(shí)踐價(jià)值的研究課題，長期以來一直都是國內(nèi)外青貯飼料研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。因此，了解牧草附著微生物及青貯過程微生物群落組成與演替信息可為有效調(diào)控青貯飼料的發(fā)酵過程和調(diào)制優(yōu)質(zhì)的青貯飼料提供科學(xué)依據(jù)。

1 青貯微生物群落及其在青貯過程中的演替

自然新鮮的牧草表面附著的微生物不管是從組成上還是數(shù)量上都與青貯過程中及青貯結(jié)束的樣品有很大差異，而且附著乳酸菌在萎蔫和切碎的過程中會(huì)有所增加[6-7]。Bao等[8]利用三代測(cè)序技術(shù)研究顯示，青貯前后苜蓿樣品中檢測(cè)到的微生物共有超過960種，且青貯前巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而青貯后乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)占優(yōu)勢(shì)。有利于青貯發(fā)酵且在青貯過程中起主導(dǎo)作用的主要是厚壁菌門的乳酸菌，包括乳桿菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)腸球菌(Enterococcus)及鏈球菌(Streptococcus)6個(gè)屬[9-10]，不利于青貯及引起青貯腐敗的有好氧性菌、酵母、霉菌和大腸菌類。隨著青貯過程的推進(jìn)，青貯微生物群落結(jié)構(gòu)處在不斷變化中。

1.1 牧草表面附著的微生物

植物表面環(huán)境對(duì)微生物生長具有很大影響，濕度、太陽輻射、植物表面結(jié)構(gòu)、植株?duì)I養(yǎng)分布等都是這個(gè)環(huán)境中影響附著微生物的關(guān)鍵因素[11]。植物表面附著的細(xì)菌主要是好氧性菌，真菌主要是酵母和霉菌，還會(huì)附著一些放線菌，而有利于青貯發(fā)酵的乳酸菌相對(duì)來說較少[4, 12]。由于植物表面環(huán)境的特殊性，使得不同植物以及同種植物生長在不同環(huán)境，其表面附著的微生物在種類和數(shù)量上都存在很大差異[13]。

就微生物數(shù)量來說，牧草表面附著的乳酸菌為101～106cfu·g-1FM，酵母101～107cfu·g-1FM，霉菌101～106cfu·g-1FM，因不同牧草種類、生長環(huán)境和生育期等表現(xiàn)出差異[14-20]。Cai等[21]對(duì)同一地點(diǎn)采集的玉米(Zeamays)、高粱(Sorghumbicolor)、苜蓿(Medicagosativa)及意大利黑麥草(Loliummulti·orum)表面附著微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這4種牧草表面附著的好氧細(xì)菌大概106cfu·g-1FM，腸球菌、明串珠菌、霉菌及酵母為104～105cfu·g-1FM，乳桿菌和片球菌為103cfu·g-1FM；其中高粱和黑麥草表面附著的片球菌只有100.2cfu·g-1FM，苜蓿表面附著的乳桿菌也只有100.2cfu·g-1FM；玉米表面附著的乳酸菌總數(shù)是高粱和苜蓿的2倍，是黑麥草的20倍，其結(jié)果如表1所示。

表1 不同牧草表面附著微生物種類及數(shù)量/ log10 cfu·g-1 FMTable 1 Epiphytic microorganism species and numbers on forages/log10 cfu·g-1 FM

同種牧草表面附著的微生物種類也存在差異，從Cai[18,21]對(duì)苜蓿、高粱、黑麥草等表面附著微生物在屬水平的研究看出，苜蓿表面附著的乳酸桿菌極少(<101cfu·g-1FM)，而相對(duì)來說明串珠菌較多(105cfu·g-1FM)；高粱表面附著的片球菌極少，而乳酸桿菌和腸球菌較多(104～105cfu·g-1FM)。不同牧草表面附著的微生物種類也存在很大差異。有研究表明，闊葉植物上分離到的細(xì)菌多樣性遠(yuǎn)高于狹葉植物[13]。Huili Pang等[22]從青貯前的玉米、水稻、高粱及苜蓿樣品中分離鑒定了乳酸菌110株，結(jié)果表明：玉米表面主要附著的是食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)和融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)；高粱和水稻表面主要附著植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)；而苜蓿表面主要附著植物乳桿菌、類植物乳桿菌(lactobacillusparaplantarum)及假腸膜明串珠菌(Leuconostocpseudomesenteroides)。

由此可以看出，不同牧草表面附著的微生物種類和數(shù)量都有很大的差異，同種牧草生長在不同環(huán)境其表面附著的微生物也存在差異。而且牧草不同部位附著的微生物種類和數(shù)量也存在差異。例如，Moran等[23]對(duì)黑麥草不同部位附著乳酸菌數(shù)量研究，結(jié)果如圖1所示，靠近地面部分及花序附著乳酸菌數(shù)量相對(duì)較多。

圖1 黑麥草不同部位附著乳酸菌數(shù)量
Fig.1 Epiphytic lactic acid bacteria on plant parts within ryegrass
注：?jiǎn)挝?，log10cfu·g-1(±SD)
Note: unit, log10cfu·g-1(±SD)

1.2 青貯過程中微生物的演替

青貯發(fā)酵過程中微生物存在動(dòng)態(tài)變化的過程。在這個(gè)變化過程中微生物會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，其含量會(huì)隨著青貯過程變化[24]。前人研究顯示，開始發(fā)酵后的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)牧草本身附著的好氧細(xì)菌還處于活躍期，當(dāng)發(fā)酵體系中氧氣被消耗完，青貯關(guān)鍵菌中的乳球菌開始大量繁殖并產(chǎn)生乳酸降低體系pH，酵母、霉菌及好氧細(xì)菌受到抑制，隨著發(fā)酵進(jìn)行，體系pH繼續(xù)降低，更耐酸的乳酸桿菌代替乳酸球菌主導(dǎo)發(fā)酵過程[25-26]。韓吉雨[27]用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)對(duì)玉米和苜蓿附著的乳酸菌進(jìn)行研究，結(jié)果顯示青貯前期以乳酸球菌較多，隨著發(fā)酵進(jìn)行，乳酸桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌主導(dǎo)青貯發(fā)酵過程。Eikmeyer等人[28]用宏基因組學(xué)方法研究的結(jié)果與前人相似，即隨著青貯過程的延長，由乳酸球菌演替為乳酸桿菌，其中一些異型發(fā)酵乳酸菌會(huì)產(chǎn)生一些揮發(fā)性脂肪酸，有利于青貯有氧穩(wěn)定性及長期保存[29]。

青貯過程中各種微生物的數(shù)量也存在變化，整個(gè)動(dòng)態(tài)變化過程受原料特性、發(fā)酵條件、添加劑等因素影響[30-32]。不同種微生物動(dòng)態(tài)變化過程也存在很大差異。張慧杰[33]的研究顯示發(fā)酵過程中，乳酸菌數(shù)量的最大值為 109.50～1010.38cfu·g-1FM，出現(xiàn)在發(fā)酵15天或20天。而一般青貯結(jié)束后乳酸菌數(shù)量都能達(dá)到106～108cfu·g-1FM。

1.3 接種乳酸菌對(duì)青貯微生物的影響

由于附著于牧草表面的乳酸菌主要是異型發(fā)酵乳酸菌，但數(shù)量少[34]，一般達(dá)不到優(yōu)質(zhì)青貯飼料所需乳酸菌的要求(105cfu·g-1FM)，因此很多學(xué)者研究乳酸菌添加劑以提高青貯品質(zhì)及提高青貯有氧穩(wěn)定性。然而，接種外源乳酸菌會(huì)對(duì)牧草附著微生物產(chǎn)生一定影響，且不同牧草中接種不同種乳酸菌對(duì)青貯過程中微生物群落結(jié)構(gòu)有不同的影響。Parvin和Nishino的研究表明[35]，添加植物乳桿菌抑制了羊草(Leymuschinensis)本身附著的細(xì)菌如一些腸道菌(Enterobacteria)，添加布氏乳桿菌(lactobacillusbuchneri)也會(huì)抑制附著于羊草表面的細(xì)菌，而在青貯30 d和90 d后細(xì)菌多樣性有所增加；而對(duì)意大利黑麥草、羊草、全株玉米及無芒虎尾草(Chlorisgayana)的研究表明[36]，青貯前的意大利黑麥草表面附著有腸道菌、假單胞菌(Pseudomonaspp)、伯克氏菌(Burkholderiaspp.)、沙雷氏菌(Serratiaspp.)、植物乳桿菌及糊精片球菌(Pediococcusdextrinicus)，接種了植物乳桿菌后對(duì)附著菌有一定的抑制作用但只是使DGGE條帶模糊，接種了短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)后DGGE結(jié)果表明新出現(xiàn)了短乳桿菌而其他雜菌條帶變模糊；青貯前全株玉米附著有植物乳桿菌、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等，接種了植物乳桿菌及短乳桿菌后，基本未改變?cè)屑?xì)菌的種類。李雁冰[37]研究了鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)和布氏乳桿菌對(duì)黑麥草和玉米青貯微生物群落的影響，結(jié)果顯示添加鼠李糖乳桿菌對(duì)黑麥草青貯過程的細(xì)菌和真菌群落影響大于添加布氏乳桿菌組，而添加這兩種乳酸菌對(duì)玉米青貯過程的細(xì)菌和真菌的影響都不大。也就是說，接種外源乳酸菌后會(huì)抑制牧草本身附著的微生物，尤其是不利于青貯發(fā)酵的真菌及好氧細(xì)菌，但抑制效果因牧草本身附著菌的特性及青貯條件有關(guān)。而且在青貯發(fā)酵開始后接種的乳酸菌會(huì)與牧草附著的有害菌進(jìn)行營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)并產(chǎn)生乳酸，乙酸及細(xì)菌素等代謝物質(zhì)抑制有害菌的活動(dòng)與繁殖，促使青貯過程快速有效進(jìn)行，減少營養(yǎng)物質(zhì)損失[38-39]。

2 青貯微生物對(duì)青貯飼料品質(zhì)的影響

微生物在青貯過程中的活動(dòng)及代謝產(chǎn)物會(huì)影響青貯發(fā)酵品質(zhì)。無論是牧草本身附著的微生物還是外源接種的微生物都是影響青貯飼料品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。

2.1 青貯微生物對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

在青貯發(fā)酵初期，牧草附著的好氧細(xì)菌、酵母及霉菌等利用體系殘留的氧氣消耗牧草營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行繁殖，降低飼料的青貯品質(zhì)。而隨著乳酸菌大量繁殖，代謝產(chǎn)生的乳酸能夠快速降低飼料pH從而抑制雜菌，有利于改善青貯品質(zhì)。然而，一般牧草附著的乳酸菌達(dá)不到促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程的要求，所以學(xué)者們想通過接種乳酸菌促進(jìn)青貯發(fā)酵。有很多學(xué)者的研究表明添加乳酸菌能通過迅速降低pH、減少干物質(zhì)損失、抑制雜菌、抑制蛋白降解、提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性等提高青貯品質(zhì)[40-42]。但也有研究報(bào)道，接種乳酸菌對(duì)青貯品質(zhì)沒有顯著影響甚至?xí)档颓噘A品質(zhì)[43-45]，因?yàn)楦苓m應(yīng)環(huán)境的附著微生物可能更具競(jìng)爭(zhēng)力而主導(dǎo)青貯過程[46]。Parvin等[36]指出接種乳酸菌對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的響應(yīng)不同，所以接種乳酸菌的效果不但要看青貯產(chǎn)物還應(yīng)看其對(duì)附著微生物群落影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。韓吉雨[27]在苜蓿和玉米青貯研究中得出的結(jié)論是原料表面附著的細(xì)菌貫穿整個(gè)發(fā)酵過程，影響著青貯品質(zhì)，這些菌群也存在演替的過程，說明牧草本身附著的微生物對(duì)青貯品質(zhì)影響很大。然而對(duì)青貯微生物群落及演替機(jī)理的研究還不清楚，需要了解更多信息來揭示這個(gè)復(fù)雜的發(fā)酵過程。

2.2 青貯微生物對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的影響

當(dāng)青貯飼料拆封接觸空氣后，那些在青貯過程中被抑制而未死亡的好氧細(xì)菌、酵母及霉菌就會(huì)開始活躍進(jìn)行生長繁殖，飼料的pH值和溫度開始升高，同時(shí)腐敗菌會(huì)利用乳酸及飼料營養(yǎng)物質(zhì)，使得青貯飼料品質(zhì)下降，進(jìn)而影響家畜采食量及生產(chǎn)性能。因此，青貯飼料有氧穩(wěn)定性也是青貯品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，目前研究認(rèn)為異型乳酸菌可產(chǎn)生一些揮發(fā)性脂肪酸，有利于提高青貯有氧穩(wěn)定性，盡管會(huì)消耗更多的營養(yǎng)物質(zhì)[47]。這些有利于提高飼料有氧穩(wěn)定性的有機(jī)物主要是布氏乳桿菌的代謝產(chǎn)物，包括乙酸和1，2-丙二醇[48-49]。但也有研究表明，乳酸菌提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的主要原因是其代謝產(chǎn)生的其他物質(zhì)(表2)。由此可見，青貯飼料發(fā)酵過程中乳酸菌代謝產(chǎn)生的能夠提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性的物質(zhì)多樣且與乳酸菌的種類有關(guān)。Krystynad等[17]研究顯示接種植物乳桿菌后有氧穩(wěn)定性是對(duì)照的兩倍，接種布氏乳桿菌的有氧穩(wěn)定性更高。但很多牧草附著微生物中異型乳酸菌在數(shù)量上也不足發(fā)揮主導(dǎo)作用，更多需要接種外源異型乳酸菌。郭旭生報(bào)道[50]指出異型發(fā)酵乳酸菌的添加量大于1.0×106cfu·g-1FM時(shí)，才能有效提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。然而馬迪等[51]的研究顯示，全株青貯玉米在青貯的14和56天時(shí)對(duì)照組和添加鼠李糖乳桿菌組的有氧穩(wěn)定性無差異，青貯90天的玉米中添加鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌組未能顯著提高有氧穩(wěn)定性；Kleinschmit[52]研究了添加布氏乳桿菌和戊糖片球菌對(duì)玉米青貯有氧穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明添加這兩種乳酸菌并不能顯著提高青貯有氧穩(wěn)定性。所以牧草本身附著的微生物在青貯有氧穩(wěn)定性方面有不可忽視的作用，不能為了提高品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性盲目添加乳酸菌劑，還需要了解原料本身微生物附著情況及特點(diǎn)進(jìn)行有針對(duì)性地接種菌劑。

表2 提高有氧穩(wěn)定性的微生物種類及其代謝產(chǎn)物Table 2 Microorganism species and their metabolites for improving the aerobic stability of silage

3 小結(jié)

牧草附著微生物受很多因素影響，不同牧草種類以及同種牧草生長在不同生長環(huán)境，其表面附著的微生物種類和數(shù)量都存在很大差異，且在青貯過程中處于不斷演替變化中，不同程度影響著青貯品質(zhì)。為更有效地提高青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性，學(xué)者更多的研究了接種外源乳酸菌對(duì)青貯的影響，接種菌在青貯體系中與本身附著的微生物互相競(jìng)爭(zhēng)，共同完成青貯發(fā)酵過程，但牧草本身附著微生物的作用也不可忽視。了解牧草表面附著微生物特性是決定是否需要接種乳酸菌添加劑的重要依據(jù)。未來需要研究更多關(guān)于青貯微生物組學(xué)、代謝組學(xué)及青貯過程微生物活性等信息以掌握復(fù)雜的青貯過程，為調(diào)控優(yōu)質(zhì)的青貯飼料提供科學(xué)依據(jù)。