李紅飛，王 軍，王?；?，李德印，葉曉敏，米俊憲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

哺乳動物促卵泡素氨基酸序列特征及其單克隆抗體的制備與鑒定

李紅飛，王 軍，王海花，李德印，葉曉敏，米俊憲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

為制備哺乳動物促卵泡素(FSH)單克隆抗體，比對了人類、家畜、部分野生動物、鼠類等哺乳動物FSH氨基酸序列，分析其種間同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn),多種哺乳動物FSH β亞基氨基酸序列的同源性高于80%，且線性抗原表位高度保守。從奶牛垂體組織擴(kuò)增FSH β亞基CDS片段，構(gòu)建pET28a-FSH重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)FSH重組蛋白，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞孔，取效價最高孔進(jìn)行克隆和亞克隆，獲得1株能夠分泌抗FSH的單克隆抗體細(xì)胞株，命名為B4A5。B4A5細(xì)胞株經(jīng)過數(shù)次傳代培養(yǎng)、反復(fù)凍融后生長狀態(tài)良好，且能夠穩(wěn)定分泌抗體。采用細(xì)胞株體外培養(yǎng)和小鼠腹水誘生法均制備了抗FSH的單克隆抗體，其效價分別為1∶640、1∶106。分別采用Western blot和間接ELISA法鑒定單克隆抗體的結(jié)合特異性和交叉反應(yīng)性，結(jié)果顯示，制備的單克隆抗體與FSH反應(yīng)呈陽性，與促黃體素(LH)、促甲狀腺素(TSH)、促乳素(PRL)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)均無交叉反應(yīng)性。綜上，獲得了1株能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體可特異性結(jié)合FSH蛋白。

哺乳動物； 促卵泡素； 序列特征； 單克隆抗體

促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)是一種糖蛋白類促性腺激素[1]，由α亞基和β亞基以共價鍵形式連接，2個亞基均有糖基化位點(diǎn)，糖基以N-糖苷鍵方式與之連接[2]。研究表明，F(xiàn)SH廣泛存在于人、牛、羊、馬、豬、犬、貓、鹿、虎、大熊貓等多種哺乳動物和雞、鴨、鵝等禽類及部分魚類[3-4]。FSH由垂體前葉合成和分泌[5-6]，通過血液循環(huán)作用于卵巢、睪丸等靶器官，能夠促進(jìn)母畜卵泡生長發(fā)育，刺激卵巢生長，增加卵巢質(zhì)量[7]；刺激公畜曲細(xì)精管上皮和次級精母細(xì)胞的發(fā)育，促進(jìn)精子釋放[8]。FSH分泌量不足或者不分泌，會引起母畜發(fā)情延遲甚至不發(fā)情，造成母畜不孕[9]；可引起公畜性欲降低、精子數(shù)目減少、活性降低，造成公畜不育[10]。FSH分泌不足或缺乏是家畜不育的一個重要病因，能夠造成家畜生產(chǎn)能力下降，經(jīng)濟(jì)效益降低。不育對野生保護(hù)動物繁育過程影響更大，能引起后代的數(shù)量減少、質(zhì)量降低，嚴(yán)重者會造成種群滅絕[11-12]。因此，測定血液中FSH含量對于分析哺乳動物不育癥的發(fā)病原因有重要的臨床意義。而抗FSH的單克隆抗體可以用來測定血液中FSH含量，鑒于此，比對了常見哺乳動物FSH的氨基酸序列特征，表達(dá)其種間同源性高、抗原表位保守的區(qū)域，制備抗FSH的單克隆抗體，旨在為檢測哺乳動物血液FSH含量及研究哺乳動物不育原因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器

TRIZol試劑購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo d(T)引物、DNA聚合酶、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T載體、T4 DNA 連接酶、質(zhì)粒抽提試劑盒、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ/EcoR Ⅰ、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、熒光標(biāo)記的羊抗小鼠二抗均購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker購自Fermentas公司；His-Bind Resin樹脂購自Merck公司；PEG4000、弗氏不完全佐劑(IFA)、弗氏完全佐劑(CFA)購自Sigma公司；FSH、促黃體素(LH)、促甲狀腺素(TSH)、促乳素(PRL)粉劑(豬垂體組織提取物)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)粉劑均購自寧波市第二激素廠。

PCR儀、高速低溫臺式離心機(jī)由Eppendorf公司生產(chǎn)；凝膠成像儀由GE公司生產(chǎn)；電泳儀、轉(zhuǎn)印儀購自Bio-Rad公司；雙色紅外激光成像儀購自O(shè)dyssey公司。

1.2供試材料

體質(zhì)量約20 g的雄性Balb/c小鼠、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21(DE3)購自北京天根生化科技有限公司；pET28a(+)表達(dá)載體由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存；奶牛垂體組織由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物飼養(yǎng)基地提供。

1.3常見哺乳動物FSH氨基酸序列特征分析

通過NCBI分別查找了牛、人、猴、馬、豬等常見哺乳動物FSH、LH、TSH等垂體激素α亞基的氨基酸序列，將同一物種的垂體激素α亞基和不同物種FSH的α亞基分別進(jìn)行比對。通過NCBI分別查找牛、人、綿羊、山羊、馬、豬、犬、梅花鹿、虎、大熊貓、麝鹿、家鼠、裸鼠、金倉鼠等哺乳動物的FSH β亞基氨基酸序列，分別比對人與部分家畜、牛與常見野生動物、牛與部分嚙齒類動物的氨基酸序列，分析哺乳動物FSH β亞基種間氨基酸序列特征。同時應(yīng)用線性抗原表位在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)預(yù)測FSH β亞基的線性抗原表位。

1.4奶牛垂體組織cDNA的制備

稱取100 mg奶牛垂體組織，加入1.5 mL TRIZol試劑，用玻璃勻漿器研磨均勻。按TRIZol試劑說明進(jìn)行操作，提取奶牛垂體組織總RNA。按照試劑使用說明，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo d(T)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.5FSH重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

根據(jù)1.3比對結(jié)果，選擇奶牛FSH β亞基氨基酸序列為原核表達(dá)的目的片段。根據(jù)GenBank中奶牛FSH β亞基的mRNA序列，除去編碼信號肽的堿基，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為387 bp。引物序列為 F:5′-GTGAATTCAGCTGCGAGCTGACCAACATCA-3′；R:5′-GTCTCGAGATCTTGGATGTTTTGGTCCTTTA-3′。上、下游引物下劃線部分分別為引入的EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物由上海英俊生物工程有限公司合成。

取2 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后與pET28a(+)載體分別進(jìn)行EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選陽性克隆抽提質(zhì)粒，分別用雙酶切及測序法鑒定，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pET28a-FSH。

將pET28a-FSH重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用0.8 mol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)FSH重組蛋白，將收集菌液進(jìn)行反復(fù)凍融、超聲裂解，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用His-Bind Resin樹脂純化FSH重組蛋白，BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定其質(zhì)量濃度。

1.6FSH單克隆抗體的制備

1.6.1 免疫脾細(xì)胞的制備 用生理鹽水將純化的FSH重組蛋白質(zhì)量濃度配制為1 mg/mL，與弗氏佐劑等體積混勻，背部皮下分點(diǎn)注射法免疫小鼠，劑量0.2 mL/只。首次免疫用弗氏完全佐劑，第2、3次加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑，每次免疫間隔2周。于第3次加強(qiáng)免疫后第7天，眼眶靜脈叢采血，分離血清，間接ELISA法測定抗體效價。

間接ELISA條件：包被抗原工作質(zhì)量濃度為10 μg/mL，包被液為pH值9.6、濃度為0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液，37 ℃條件下反應(yīng)2 h；封閉液為1.0%的脫脂奶粉，37 ℃條件下封閉1 h；熒光標(biāo)記的羊抗小鼠二抗按1︰1 200稀釋。

1.6.2 細(xì)胞融合及篩選 收集小鼠腹腔細(xì)胞，作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。選擇抗體效價高的小鼠，處死后取脾細(xì)胞。取處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，與脾細(xì)胞融合，融合劑為PEG4000，脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的量分別為1×107個和2×106～5×106個。將融合后的細(xì)胞懸液加入到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，每孔加入0.1 mL進(jìn)行培養(yǎng)。

每3 d半量換液1次，第12天時吸取少量上清液，用間接ELISA法進(jìn)行篩選，以10 μg/mL FSH重組蛋白為包被抗原。同時以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，篩選陽性孔。

1.6.3 雜交瘤細(xì)胞克隆及穩(wěn)定性檢測 取1.6.2篩選的效價最高的陽性孔，采用有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞。將克隆成功的雜交瘤細(xì)胞連續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)20代，每5代測1次上清效價。將雜交瘤細(xì)胞凍存，分別于30、180 d后復(fù)蘇，擴(kuò)大培養(yǎng)后檢測其效價。

1.6.4 單克隆抗體體外制備 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，擴(kuò)大培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中逐漸降低培養(yǎng)基中血清含量，當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個瓶底時停止換液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞全部死亡。收集上清液，采用間接ELISA法測定其效價。

1.6.5 單克隆抗體腹水制備 接種雜交瘤細(xì)胞前7 d，選擇體格健壯的小鼠，腹腔注射無菌石蠟油，0.5 mL/只。取對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液將其稀釋為2×106個/mL，將細(xì)胞懸液注入小鼠腹腔，0.5 mL/只。

當(dāng)小鼠腹部明顯隆起，觸之有波動感，并出現(xiàn)精神、飲食變差時，收集腹水。4 ℃、3 000 r/min離心20 min，棄去上層石蠟油，收集中間微黃色、透明腹水，采用間接ELISA法測定其效價。

1.6.6 單克隆抗體結(jié)合特異性分析 將FSH粉劑用生理鹽水適量稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE電泳(蛋白質(zhì)用量為20 μg/孔)。電泳結(jié)束后按常規(guī)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜，漂洗，封閉；以含有抗FSH的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞上清液為一抗，孵育、漂洗；加入 1∶2 000稀釋的熒光標(biāo)記的羊抗小鼠二抗孵育、漂洗，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)分析顯色結(jié)果。設(shè)置陰性對照，以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為一抗，操作過程相同。

1.6.7 單克隆抗體交叉反應(yīng)性鑒定 用PBS液將FSH、LH、TSH、PRL、hCG稀釋至10 μg/mL，分別作為包被抗原與陽性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清反應(yīng)，采用間接ELISA法分別測定其吸光值，判定單克隆抗體的交叉反應(yīng)性。以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對照，以滅菌水為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1FSH蛋白序列特征

分別比對了人和多種哺乳動物FSH α亞基、β亞基的種間序列特征，結(jié)果表明，同一物種的FSH具有相同的α亞基，不同物種間FSH α亞基有較大的差異。不同哺乳動物的FSH β亞基同源性較高(圖1)，分析發(fā)現(xiàn),牛與常見家畜及人類,牛與梅花鹿、虎、大熊貓等野生動物,牛與家鼠、裸鼠等嚙齒類動物的氨基酸序列同源性均高于80%，最高達(dá)95%以上。

線性抗原表位預(yù)測結(jié)果顯示，在59—66位存在6個連續(xù)的抗原表位，序列位點(diǎn)為DPARPNI(T)Q，在104—116位間存在13個連續(xù)的抗原表位，序列位點(diǎn)為KCD(N)SDSTDCTVRG。人類、常見家畜、部分野生動物及鼠類的FSH β亞基的線性抗原表位高度保守。

2.2pET28a-FSH重組質(zhì)粒構(gòu)建

從奶牛垂體組織cDNAs中擴(kuò)增到與預(yù)期大小相符合的核酸片段(387 bp)(圖2)，且測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段序列正確。重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果表明，目的片段插入pET28a(+)載體，成功構(gòu)建了pET28a-FSH重組質(zhì)粒。

*表示該氨基酸序列在種間完全相同； :表示除一個物種外該 氨基酸序列在其他種間完全相同； 下劃線表示保守抗原表位圖1 常見哺乳動物FSH β亞基種間序列比對結(jié)果

M:DNA Marker； 1：FSH β亞基圖2 FSH β亞基片段擴(kuò)增結(jié)果

2.3FSH重組蛋白的表達(dá)及純化

從圖3可以看出，在約14.4 ku處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與預(yù)期重組蛋白大小一致，表明FSH重組蛋白成功表達(dá)。將收集菌液進(jìn)行反復(fù)凍融、超聲裂解，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，F(xiàn)SH重組蛋白主要位于上清中。

M：蛋白質(zhì)Marker； 1：pET28a(+)空載體； 2：pET28a-FSH重組質(zhì)粒； 3：菌液裂解上清； 4：菌液裂解沉淀； 箭頭標(biāo)示為重組蛋白圖3 pET28a-FSH重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)(A)及重組蛋白可溶性分析(B)

2.4分泌抗FSH重組蛋白的雜交瘤細(xì)胞篩選結(jié)果

表達(dá)的FSH重組蛋白免疫Balb/c小鼠后效價高于1∶5 000，達(dá)到脾細(xì)胞融合要求，可以用于細(xì)胞融合。小鼠腹腔細(xì)胞經(jīng)24 h體外培養(yǎng)后，其中的巨噬細(xì)胞貼壁、變形，活力增強(qiáng)。融合后第6～7天可在部分孔內(nèi)觀察到針狀克隆(圖4)，證明細(xì)胞融合成功。

A：貼壁腹腔巨噬細(xì)胞； B：雜交瘤細(xì)胞圖4 融合后產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞

2.5分泌抗FSH重組蛋白的雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性分析

取抗體效價最高培養(yǎng)孔，經(jīng)過多次有限稀釋法進(jìn)行克隆、亞克隆，最終獲得1株陽性單克隆細(xì)胞株，命名為B4A5。雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)、凍存后復(fù)蘇培養(yǎng)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且具有穩(wěn)定分泌抗體的能力，上清效價均在1∶640以上，最高效價達(dá)到1∶1 280(表1)。

表1 雜交瘤細(xì)胞抗體分泌穩(wěn)定性測定

2.6單克隆抗體效價檢測

間接ELISA法檢測結(jié)果表明，B4A5雜交瘤細(xì)胞上清的效價高于1∶640，腹水效價為1∶106。

2.7分泌抗FSH單克隆抗體的結(jié)合特異性

來源于哺乳動物垂體組織的FSH是由α和β 2個亞基組成，經(jīng)過SDS-PAGE解離成2條電泳帶，其中β亞基分子質(zhì)量約為14.61 ku。Western blot結(jié)果表明，利用重組蛋白片段制備的單克隆抗體和天然的FSH激素在分子質(zhì)量為14.4 ku處呈現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，而陰性對照無條帶(圖5)，表明制備的單克隆抗體能夠與天然FSH蛋白β亞基特異性結(jié)合。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker； 1：單克隆抗體上清液； 2：SP2/0骨髓瘤 細(xì)胞上清液； 箭頭標(biāo)示特異性結(jié)合條帶圖5 抗FSH單克隆抗體結(jié)合特異性分析結(jié)果

2.8分泌抗FSH單克隆抗體的交叉反應(yīng)性

B4A5雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體與FSH呈陽性反應(yīng)，與LH、TSH、PRL、hCG等糖蛋白類激素均呈陰性反應(yīng)(表2)。

表2 單克隆抗體的交叉反應(yīng)性分析結(jié)果

注：+表示發(fā)生交叉反應(yīng)；-表示不發(fā)生交叉反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

造成哺乳動物不育的原因非常復(fù)雜[1]，其中疾病性不育在哺乳動物不育中所占的比例最高。疾病性不育包括卵巢和睪丸等生殖器官疾病、子宮內(nèi)膜炎、生殖激素分泌不足或紊亂等[13]。下丘腦-垂體-性腺軸是哺乳動物最關(guān)鍵的生殖內(nèi)分泌軸，下丘腦釋放的促性腺激素釋放激素(GnRH)通過垂體門脈系統(tǒng)作用于垂體前葉，引起FSH釋放入血液[14-15]。

FSH是由垂體前葉合成和分泌的一種蛋白質(zhì)類激素，垂體前葉還合成LH、TSH、PRL等同樣由α亞基和β亞基結(jié)構(gòu)組成的激素[16]，這些垂體激素間有一定的序列同源性。本研究表明，同一物種垂體激素家族有相同的α亞基；人、家畜、常見野生動物及鼠類FSH β亞基氨基酸序列同源性均高于80%，最高同源性達(dá)95%以上。比對結(jié)果表明，常見哺乳動物FSH β亞基種間線性表位高度保守，可以作為抗體識別的共同位點(diǎn)。

本研究根據(jù)比對結(jié)果，利用單克隆抗體技術(shù)，制備了能夠穩(wěn)定分泌抗奶牛FSH β亞基單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，制備的單克隆抗體能夠特異性結(jié)合動物源性FSH，與其他垂體激素?zé)o交叉反應(yīng)，可用來測定奶牛血液中FSH含量。序列比對結(jié)果表明，人類、家畜、鼠類及常見野生動物FSH的β亞基同源性高。因此，本研究制備的單克隆抗體還可用于測定多種家畜、野生動物、鼠類等其他哺乳動物血液FSH含量。

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Sequence Signature of Mammal Follicle Stimulating Hormone and Preparation and Identification of Its Monoclonal Antibody

LI Hongfei,WANG Jun,WANG Haihua,LI Deyin,YE Xiaomin,MI Junxian

(College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China)

In orer to prepare specific monoclonal antibody against mammal FSH,amino acid sequence of FSH orthologs among human,livestock,wildlife and murids were analyzed.The results showed that the beta subunit of FSH had extremely high homology(>80%).The CDS of FSH beta subunit was amplified using cow pituitary gland cDNAs and then subcloned into pET28a(+) vector to express recombinant protein.The purified recombinant protein was used as antigen for immunization with Balb/c mice.Splenocytes of mice with the highest titer were fused with SP2/0 myeloma cells and indirect ELISA was used to select positive hybridoma cells.By series cloning and subcloning of hybridoma cells,a hybridoma named B4A5 that producing monoclonal antibody against FSH was obtained.B4A5 could successively secrete McAb with the treatment of serial subcultivation and freeze thawing for several times.The ELISA titers of McAb of cell supernatant-derived and ascites-derived was 1∶640 and 1∶106,respectively.Western blot indicated the McAb had specific binding with native FSH and indirect ELISA proved the McAb had no cross-reactivity with other gonadal hormones including LH,TSH,PRL and hCG.

mammal; FSH; sequence signature; monoclonal antibody

2017-03-22

河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16B230003)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(25000231)

李紅飛 (1982-),男，河南汝州人，講師，博士，主要從事獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)的教學(xué)與科研工作。 E-mail:15136249092@163.com

S857.2+1

： A

： 1004-3268(2017)09-0139-05