李進(jìn)福，丁海峰，李小申，劉保光，蘇 嘉，苑 麗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

河南地區(qū)豬呼吸道隱性感染大腸桿菌耐藥基因檢測(cè)及分析

李進(jìn)福，丁海峰，李小申，劉保光，蘇 嘉，苑 麗*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002)

為了解河南地區(qū)豬呼吸道隱性感染大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類及氟苯尼考的耐藥情況及耐藥基因的分布，采用微量肉湯稀釋法對(duì)從河南地區(qū)豬肺臟分離的31株大腸桿菌進(jìn)行青霉素、頭孢吡肟、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考等16種藥物敏感性檢測(cè)及耐藥表型分析，采用PCR對(duì)31株受試大腸桿菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟苯尼考耐藥基因檢測(cè)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，受試菌對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林3種藥物的耐藥率均達(dá)到100%，對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢吡肟的耐藥率分別為29.03%、32.26%、3.23%，對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素的耐藥率分別為83.87%、70.97%，對(duì)氟苯尼考的耐藥率為48.39%，但對(duì)喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、恩諾沙星)、氨基糖苷類藥物(慶大霉素、阿米卡星)較為敏感。耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因TEM、SHV、CTX-M-U、CTX-M-1、CTX-M-9的檢出率分別為54.84%、61.29%、25.81%、9.68%、9.68%；四環(huán)素類耐藥基因tet(A)、tet(M)、tet(L)的檢出率分別為87.10%、54.84%、19.35%，tet(C)、tet(O)陽(yáng)性菌各1株，未檢出tet(B)、tet(K)、tet(W)；氟苯尼考耐藥基因floR檢出率為54.84%。2株菌含有7種耐藥基因，19株菌含有4種及以上耐藥基因?？梢姡喾N耐藥基因共同介導(dǎo)大腸桿菌的多重耐藥性已呈流行趨勢(shì)。

豬； 呼吸道； 隱性感染； 大腸桿菌； 耐藥基因

近年來(lái)，混合感染已成為畜牧業(yè)發(fā)展的最大障礙，特別是呼吸道疾病的混合感染，更加復(fù)雜多樣化。大腸桿菌為主要的傳染因子，因其血清型多樣、致病力、毒力不一等特點(diǎn)給大腸桿菌的預(yù)防和治療帶來(lái)很大困難，且大腸桿菌可以同時(shí)感染人和動(dòng)物，也可通過食物鏈導(dǎo)致人發(fā)病，給人類健康、畜牧業(yè)、食品安全造成了極大威脅[1-3]。另外，隨著抗菌藥物的濫用，使得大腸桿菌多重耐藥情況嚴(yán)重，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物、四環(huán)素類藥物、氟苯尼考的耐藥情況尤為明顯[4-6]。大腸桿菌是一個(gè)天然的多重耐藥基因庫(kù)，不僅可以借助基因突變使菌株產(chǎn)生耐藥性，而且可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等多種移動(dòng)原件將耐藥基因垂直或水平傳播給其他菌株，使耐藥情況更加嚴(yán)重[7-8]?？梢?，了解大腸桿菌的耐藥情況對(duì)有效防控大腸桿菌病具有重要意義。為此，對(duì)來(lái)自河南8個(gè)地市的豬源肺臟大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，利用微量肉湯稀釋法測(cè)定受試菌株耐藥表型，采用PCR檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟苯尼考等相關(guān)耐藥基因，分析其耐藥性，檢測(cè)各耐藥基因在受試大腸桿菌中的分布，分析其耐藥分子機(jī)制，旨在為臨床抗菌藥物的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)菌株

31株供試大腸桿菌于2015年5—9月從來(lái)自鄭州(49份)、開封(23份)、新鄉(xiāng)(16份)、安陽(yáng)(4份)、平頂山(10份)、許昌(3份)、南陽(yáng)(8份)、焦作(1份)地區(qū)豬源肺臟共計(jì)114份病料(所有病料來(lái)源豬只表觀正常，但肺臟有病變)中分離。31株大腸桿菌經(jīng)BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定。藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保存中心。

1.2試驗(yàn)用培養(yǎng)基

血平板(批號(hào):20160311B)購(gòu)自鄭州博賽生物科技股份有限公司，LB肉湯(批號(hào):150414)、LB瓊脂(批號(hào):160614)、麥康凱瓊脂(批號(hào):160610)、MHB肉湯(批號(hào):150429)、TSB液體培養(yǎng)基(批號(hào):160310)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，使用時(shí)均在保質(zhì)期內(nèi)。

1.3試驗(yàn)藥品

所選藥物青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、慶大霉素、阿米卡星、泰妙菌素、氟苯尼考、磷霉素、磺胺六甲氧嘧啶，均由河南牧翔藥業(yè)有限公司提供，使用時(shí)均在保質(zhì)期內(nèi)。

1.4主要試劑

主要試劑有DL2000 DNA Marker、瓊脂糖、2×TaqMasterMix酶(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，熒光染料溴化乙錠(上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，50×TAE(北京索萊寶生物科技有限公司)等。

1.5主要儀器

BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(美國(guó)BD公司)、細(xì)菌比濁儀(法國(guó)Biomerieux公司)、離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、PCR儀(美國(guó)ABI公司)、DYY-BC型電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)等。

1.6細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

無(wú)菌取少量肺臟涂布于血平板培養(yǎng)基上，在37 ℃無(wú)菌恒溫箱中孵育24 h，挑取單個(gè)菌落接種于LB肉湯中進(jìn)行增菌培養(yǎng)，水浴搖床37 ℃培養(yǎng)8～12 h，然后接種于麥康凱瓊脂平板上，以上操作反復(fù)3次純化菌落。然后觀察其形態(tài)特征，取單個(gè)菌落經(jīng)BD PhoenixTM-100全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，取其中的大腸桿菌純培養(yǎng)后備用。

1.7藥物敏感性試驗(yàn)

1.7.1 藥物的制備 用分析天平精密稱取各種適量藥物后，無(wú)菌操作用適當(dāng)?shù)娜軇┡渲瞥少|(zhì)量濃度為5 120 μg/mL的藥液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期限?個(gè)月。

1.7.2 菌液的制備 無(wú)菌環(huán)境下挑取少量保存的細(xì)菌，接種到LB肉湯中，37 ℃、210 r/min搖床中振搖過夜培養(yǎng)，經(jīng)麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定菌液濁度為109cfu/mL備用。以大腸埃希氏菌ATCC25922為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌，試驗(yàn)時(shí)受試菌菌懸液濃度為5×105cfu/mL。

1.7.3 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用CLSI(2015)推薦的微量肉湯稀釋法。采用相同方法分別將每株細(xì)菌每種藥物重復(fù)3次，觀察并記錄結(jié)果，按CLSI(2015)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.8耐藥基因PCR擴(kuò)增

1.8.1 模板的制備 采用煮沸裂解法制備31株大腸桿菌受試菌株的DNA模板，放入-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的基因序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 相關(guān)耐藥基因引物序列

注：引物序列中Y=C或者T。

1.8.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系20 μL：模板1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各 1 μL， 2×TaqMasterMix 10 μL，無(wú)菌去離子水7 μL。PCR反應(yīng)退火溫度詳見表1。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)攝像。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行分析，并應(yīng)用在線軟件http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast進(jìn)行比對(duì)，確定基因亞型。

2 結(jié)果與分析

2.1藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

由表2可知，大腸桿菌對(duì)青霉素、氨芐西林、阿莫西林的耐藥率均為100%，對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢吡肟的耐藥率分別為29.03%、32.26%、3.23%，對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素耐藥率分別為83.87%、70.97%，對(duì)氟苯尼考耐藥率為48.39%，但對(duì)喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星、恩諾沙星，氨基糖苷類藥物阿米卡星、慶大霉素較為敏感。

表2 大腸桿菌對(duì)不同抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因 圖1為TEM基因的擴(kuò)增結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果顯示，TEM、SHV、CTX-M-U檢出率分別為54.84%、61.29%、25.81%，其中，屬于CTX-M-1亞群、CTX-M-9亞群的大腸桿菌各3株，占9.68%。

M：DL2000 DNA Marker； P:陽(yáng)性對(duì)照； N:陰性對(duì)照； 1—15：部分供試大腸桿菌圖1 大腸桿菌TEM基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 四環(huán)素類耐藥基因 圖2為tet(M)基因的擴(kuò)增結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果顯示，27株供試大腸桿菌四環(huán)素耐藥基因tet(A)陽(yáng)性，檢出率為87.10%；tet(C)與tet(O)陽(yáng)性菌均檢測(cè)出1株；17株tet(M)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為54.84%，且17株tet(M)陽(yáng)性菌株中有16株同時(shí)也攜帶有tet(A)；6株tet(L)耐藥基因呈陽(yáng)性，檢出率為19.35%；另外，tet(B)、tet(K)、tet(W)檢測(cè)陰性。

2.2.3 氟苯尼考耐藥基因 圖3為floR基因的擴(kuò)增結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果顯示，17株供試大腸桿菌floR基因陽(yáng)性，檢出率為54.84%。

M：DL2000 DNA Marker； P.陽(yáng)性對(duì)照; N.陰性對(duì)照； 1—15：部分供試大腸桿菌圖2 大腸桿菌tet(M)基因的擴(kuò)增結(jié)果

M：DL2000 DNA Marker； P.陽(yáng)性對(duì)照; N.陰性對(duì)照； 1—13：部分供試大腸桿菌圖3 大腸桿菌floR基因的擴(kuò)增結(jié)果

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明，含有2種耐藥基因的菌株有30株，占受試菌株的96.77%，2株受試大腸桿菌含有7種耐藥基因，19株受試大腸桿菌含有4種及以上耐藥基因。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)中分離菌株對(duì)青霉素、氨芐西林及阿莫西林耐藥率達(dá)到100%，對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻呋的耐藥率分別為32.26%、29.03%，對(duì)第4代頭孢菌素頭孢吡肟耐藥率僅為3.23%；對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，31株豬源肺臟大腸桿菌TEM檢出率為54.84%，SHV檢出率為61.29%，CTX-M-U檢率為25.81%，其中屬于CTX-M-1亞群與CTX-M-9亞群的菌株均占9.68%。田國(guó)寶等[9]報(bào)道，602株大腸桿菌分離株對(duì)氨芐西林耐藥率為88.37%，頭孢噻呋耐藥率為11.63 %；耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，35株CTX-M陽(yáng)性，占比5.81%，且檢測(cè)出的CTX-M均為CTX-M-1亞群，20株SHV陽(yáng)性，占比3.32%，53株菌TEM陽(yáng)性，占比8.80%。整體上，其耐藥基因檢出率低于本試驗(yàn)中的檢出率。另外，本試驗(yàn)受試菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況也明顯高于張濟(jì)培等[10]于廣東地區(qū)分離的大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥結(jié)果。本試驗(yàn)受試菌株對(duì)頭孢噻肟的耐藥率與史秋梅等[11]的檢測(cè)結(jié)果相似。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)中，31株受試大腸桿菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥情況檢測(cè)結(jié)果與其他來(lái)源大腸桿菌流行情況一致，且呈一定上升趨勢(shì)，但區(qū)域間流行情況略有不同。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離大腸桿菌對(duì)四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為83.87%、70.97%，可能與四環(huán)素類藥物的大量使用有關(guān)。此外，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，推測(cè)本試驗(yàn)中分離菌株耐藥基因可能位于可移動(dòng)原件轉(zhuǎn)座子及質(zhì)粒上，這也為其高度耐藥起到了決定性作用。tet(A)檢出率達(dá)到87.10%，與Schwaiger等[13]的檢測(cè)結(jié)果(90.13%)接近；本試驗(yàn)中，tet(M)檢出率為54.84%，且17株tet(M)陽(yáng)性菌株中有16株同時(shí)也攜帶有tet(A)，其原因可能為tet(M)位于可結(jié)合的轉(zhuǎn)座子上，而可結(jié)合的轉(zhuǎn)座子又可以轉(zhuǎn)座多個(gè)四環(huán)素耐藥基因[14]。

前人研究表明，大腸桿菌floR耐藥基因存在于可結(jié)合質(zhì)粒上，便于其水平傳播，且floR耐藥基因位于大腸桿菌染色體上，可以通過基因盒傳遞其耐藥表型[15-18]。本試驗(yàn)中分離大腸桿菌氟苯尼考耐藥基因floR檢出率為54.84%?？赡苁怯捎诜侥峥妓幬镩L(zhǎng)期添加于飼料中造成的。

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Detection and Analysis ofEscherichiacoliResistance Gene in Recessive Infection of Pigs in Henan Province

LI Jinfu,DING Haifeng,LI Xiaoshen,LIU Baoguang,SU Jia,YUAN Li*

(Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to understand the distribution of the resistance gene and drug resistance to β-lactam antibiotics,Tetracycline antibiotics and Florfenicol of the pig silent infection pathogenic bacteria in the respiratory tract in Henan province,the mircrobroth dilution method was adopted to analyze the drug resistance phenotypes and the drug susceptibility to 16 kinds of drugs such as Penicillin,Cefepime,Gentamycin,Doxycycline and Florfenicol of 31 stains ofEscherichiacoliisolated from the pig lungs in Henan province,and the PCR was adopted to analyze the drug resistance genes to β-lactam antibiotics,Tetracycline antibiotics and Florfenicol of 31 strains ofEscherichiacoli.The results showed that the drug resistance rates of the tested bacteria to Penicillin,Ampicillin and Amoxicillin were 100%,the drug resistance rates of the tested bacteria to Ceftiofur Cefotaxime and Cefepime respectively were 29.03%,32.26% and 3.23%,the drug resistance rates of the tested bacteria to Tetracycline and Doxycycline respectively were 83.87% and 70.97%,and the drug resistance rates of the tested bacteria to Florfenicol was 48.39%. The tested bacteria were more sensitive to Quinolones,such as Ciprofloxacin and Enrofloxacin,and Aminoglycosides,such as Gentamycin and Amikacin. The detection rate of β-lactam antibiotics resistance gene such as TEM,SHV,CTX-M-U,CTX-M-1 and CTX-M-9 respectively were 54.84%,61.29%,25.81%,9.68% and 9.68%,the detection rate of Tetracycline antibiotics resistance gene such astet(A),tet(M) andtet(L) were respectively 87.10%,54.84% and 19.35%,the positive bacteria oftet(C) andtet(O) are all detected one strain,tet(B),tet(K) andtet(W) were not detected,and the detection rate of Florfenicol resistance gene(floR) was 54.84%.Two strains of bacteria had seven resistance genes and 19 strains had four or more resistant genes.It can be seen that multiple drug resistance genes co-mediated the multidrug resistance ofEscherichiacolihad become a popular trend.

porcine; respiratory tract; recessive infection;Escherichiacoli; resistance gene

2017-04-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201965)

李進(jìn)福(1989-)，男，河南鶴壁人，在讀碩士研究生，研究方向：藥理學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)。 E-mail：lijinfu4550@163.com

*通訊作者：苑 麗(1973-)，女，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事藥理學(xué)與毒理學(xué)及細(xì)菌耐藥分子機(jī)制的研究。 E-mail:liyuanhn03@henau.edu.cn

S855.1

： A

： 1004-3268(2017)09-0144-05