劉保國，李小娟，何松林,2*，王 政，尚文倩，王慧霞，賀 丹

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗生長的影響

劉保國1，李小娟1，何松林1,2*，王 政1，尚文倩1，王慧霞1，賀 丹1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

為提高紅葉石楠試管苗的質(zhì)量，以紅葉石楠品種紅羅賓(Photiniafraseri‘Red Robin’)試管苗為材料，在無糖培養(yǎng)條件下，研究組織培養(yǎng)微環(huán)境中不同體積分?jǐn)?shù)CO2[0(CK)、0.1‰、0.2‰、0.3‰]對紅葉石楠試管苗生長的影響。結(jié)果表明：當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為0.2‰時，紅葉石楠試管苗的株高、葉數(shù)、葉長、根數(shù)、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素指數(shù)、根系活力等指標(biāo)均達到最大值；CK的葉幅最大，但與其他處理差異不顯著；紅葉石楠試管苗的地上部干物率隨著CO2體積分?jǐn)?shù)增加而下降，而根部干物率隨著CO2體積分?jǐn)?shù)增加而上升；氣孔密度與氣孔面積呈負(fù)相關(guān)，CO2體積分?jǐn)?shù)為0.2‰時，氣孔密度最大，氣孔面積最小。綜合而言，對紅葉石楠試管苗進行無糖培養(yǎng)時，CO2體積分?jǐn)?shù)為0.2‰最適宜生長。

組織培養(yǎng)； 紅葉石楠； CO2體積分?jǐn)?shù)

紅葉石楠(Photiniafraseri)屬薔薇科石楠屬(Photinia)，由中國產(chǎn)的石楠(Ph.serrulate)與光葉石楠(Ph.glabra)雜交而成，為常綠小喬木，因其新梢和嫩葉鮮紅而得名，被譽為“綠籬之王”“紅葉貴妃”等[1]，尤其是冬季景觀效果好，深受人們的喜愛。近年來，國內(nèi)外相繼開展了紅葉石楠的扦插快繁技術(shù)和組培快繁技術(shù)研究[2-6]。但傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)，特別是針對木本植物，普遍存在許多問題，如污染率高、移栽成活率低、培養(yǎng)周期長等[7-8]。因此，提高試管苗的光合自養(yǎng)能力，并加快其生長是完善紅葉石楠組培技術(shù)、縮短生產(chǎn)周期的一種有效途徑。

組培環(huán)境主要有培養(yǎng)基成分、瓶內(nèi)氣體(CO2及乙烯)、碳源、光照、濕度等[9-10]，其中，CO2是植物光合作用所需碳源的主要來源，但是傳統(tǒng)的組培容器多采用密封性較好的材料封閉容器口，限制了容器內(nèi)外的氣體交換，使培養(yǎng)物在光照期間處于CO2饑餓狀態(tài)，進而對植物產(chǎn)生不利影響[11-12]。有研究表明，增施CO2條件下，大花蕙蘭、葡萄、彩色馬蹄蓮、梨、甘薯、非洲菊等[11,13-17]植物的試管苗均提高了光合自養(yǎng)能力，其形態(tài)指標(biāo)(葉長、根長、株高等)以及葉綠素含量、葉片氣孔密度等生理生化指標(biāo)均高于無CO2施用處理。近年來，有關(guān)紅葉石楠組織培養(yǎng)的報道主要集中在外植體消毒、培養(yǎng)基選擇、愈傷組織誘導(dǎo)[1-3]等方面，而有關(guān)微環(huán)境中CO2體積分?jǐn)?shù)變化對紅葉石楠試管苗生長的影響研究未見報道。鑒于此，研究組織培養(yǎng)微環(huán)境中不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗生長的影響，以期尋求其最佳的培養(yǎng)條件，提高其商品苗質(zhì)量，為加快其產(chǎn)業(yè)化進程提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 試驗材料 供試紅葉石楠品種為紅羅賓(Photiniafraseri‘Red Robin’)，試管苗(約1.5 cm高)由鄢陵北方花卉集團提供。將試管苗增殖培養(yǎng)30 d左右，并選取生長狀況一致的試管苗作為試驗材料。

1.1.2 樹脂膜培養(yǎng)容器 CO2施肥培養(yǎng)容器(culture pack，CP)[18]由日本川大香學(xué)農(nóng)學(xué)部提供，該容器以高分子樹脂膜為材料制作而成，樹脂膜厚度為25 μm。

1.2方法

1.2.1 培養(yǎng)方式與條件 參考何松林等[19]的塑膜·巖棉(culture pack rockwool system，CP·RW)培養(yǎng)方式。首先將培養(yǎng)容器和作為培養(yǎng)基支持體的巖棉塊滅菌，其中培養(yǎng)容器于121 ℃高壓蒸汽滅菌17 min，巖棉塊于150 ℃恒溫干燥箱內(nèi)滅菌90 min，之后在超凈工作臺內(nèi)將巖棉塊移入培養(yǎng)容器內(nèi)，并注入已滅菌的液體培養(yǎng)基。將紅葉石楠試管苗接種完成后，用容器蓋封口，即可放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，光照強度為25 μmol/(m2·s)，光照時數(shù)為14 h/d(6:00—20:00)，培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃，培養(yǎng)時間為60 d。

1.2.2 接種方法 從三角瓶中挑選出大小均一的試管苗(株高約2.5 cm)，在無菌條件下接入CP培養(yǎng)容器內(nèi)(每孔接種1株)。每容器接種25株試管苗，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 CO2體積分?jǐn)?shù)處理設(shè)置 培養(yǎng)箱內(nèi)CO2體積分?jǐn)?shù)由CO2控制儀進行控制，其體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為0(CK)、0.1‰、0.2‰、0.3‰，將紅葉石楠試管苗接種于巖棉支持體上進行生根誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)基用量為180 mL，pH=5.8。

1.2.4 形態(tài)及生理指標(biāo)的測定

1.2.4.1 形態(tài)指標(biāo) 形態(tài)指標(biāo)分別為株高、葉數(shù)、葉長(試管苗自下而上的第3片葉)、葉幅、根數(shù)、最長根長，整株鮮質(zhì)量與干質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量與干質(zhì)量、根部鮮質(zhì)量與干質(zhì)量，整株干物率、地上部干物率和根部干物率。以上各指標(biāo)在試管苗培養(yǎng)60 d后，隨機選取15株樣品測定，測定干質(zhì)量時，用剪刀將試管苗的根全部剪下后，分地上部和根部分別進行烘干和稱質(zhì)量。烘干時首先將植物材料在105 ℃條件下殺青30 min，之后移入恒溫干燥箱，在60 ℃條件下繼續(xù)加熱干燥48 h后測定。

整株干物率=總干質(zhì)量/總鮮質(zhì)量×100%,

地上部干物率=地上部干質(zhì)量/地上部鮮質(zhì)量×100%,

根部干物率=根部干質(zhì)量/根部鮮質(zhì)量×100%。

1.2.4.2 葉綠素含量(SPAD值) 使用MINOITA SPAD 502 葉綠素儀測定SPAD值，在培養(yǎng)60 d時，用葉綠素儀測量頭夾住試管苗自下而上第3片葉，每片葉均重復(fù)3次，取其平均值。

1.2.4.3 葉片下表皮氣孔的觀察 采用Dami等[20]的指甲油印模法。在40×光學(xué)顯微鏡下，每個處理隨機選取10個視野，統(tǒng)計氣孔密度。在100×光學(xué)顯微鏡下，每處理隨機選取10個氣孔器，測定其長度和寬度，計算氣孔面積，氣孔面積(μm2)=長(μm)×寬(μm)。

1.2.4.4 根系活力 根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[21]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用鄧肯氏新復(fù)極差測驗法(SSR法)測驗不同處理的差異顯著性，顯著水平P<0.05。采用DPS軟件7.05和Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗形態(tài)的影響

從表1可以看出，CO2體積分?jǐn)?shù)為0.2‰時株高達到最大，且與其他處理差異顯著；0.2‰ CO2處理和CK的試管苗葉數(shù)均最大；隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的增加，葉長呈先升高后降低的趨勢，且在0.2‰ CO2處理下達到最大值；葉幅以CK最大，但與其他處理差異不顯著；隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的增加，根數(shù)呈先上升后下降的趨勢，0.2‰ CO2處理根數(shù)達到最多，但與其他處理差異不顯著；0.2‰ CO2處理根長最大，且與其他處理差異顯著。綜合而言，紅葉石楠試管苗的形態(tài)指標(biāo)均以0.2‰ CO2處理最好，在0.3‰ CO2處理時，雖然CO2體積分?jǐn)?shù)增加，但是其形態(tài)指標(biāo)反而沒有0.2‰ CO2處理好，說明適宜濃度的CO2可以使紅葉石楠試管苗生長良好，濃度過高反而不利于其生長。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗形態(tài)的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。

2.2不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量及干物率的影響

如表2所示，隨著CO2體積分?jǐn)?shù)增加，紅葉石楠試管苗整株、地上部及根部的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量呈先升高后降低趨勢，均以0.2‰ CO2處理最大。如圖1所示，整株干物率均隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的增加先下降后上升，但處理間差異不顯著；地上部干物率隨CO2體積分?jǐn)?shù)的增加而下降，而根部干物率與地上部干物率呈負(fù)相關(guān)，即根部干物率隨著CO2體積分?jǐn)?shù)增加而上升，在0.3‰ CO2處理達到最大，說明CO2體積分?jǐn)?shù)增加對植物根部干物質(zhì)積累起促進作用。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響

不同字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著(P<0.05)，下圖同圖1 不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗干物率的影響

2.3不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗葉綠素含量的影響

如圖2所示，CO2體積分?jǐn)?shù)為0、0.1‰、0.2‰時，紅葉石楠試管苗SPAD值差異不顯著，但在0.2‰ CO2處理時SPAD值最高。植物進行光合作用的能量來源主要來自光合色素捕獲的光能，所以葉綠素的高低與光合作用密切相關(guān)，增施CO2可以增加葉綠素總含量，降低葉綠素a/b值，更好地利用散射光，進一步提高光能利用率以提高光合作用[22]。當(dāng)CO2體積分?jǐn)?shù)為0.3‰時，SPAD值最低，且與其他3個處理差異顯著，說明適宜濃度的CO2可以提高植株葉綠素含量，濃度過高則可能導(dǎo)致植物無氧呼吸，抑制光合作用，從而降低葉綠素含量。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗SPAD值的影響

2.4不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗根系活力的影響

如圖3所示，隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的增加，試管苗的根系活力呈先上升后下降趨勢，體積分?jǐn)?shù)為0.2‰時根系活力最高，且與其他處理差異顯著。環(huán)境中CO2的濃度越高，植物的光合作用越強，因為植株地下根部要吸收營養(yǎng)以供地上部分生長，所以植株根系活力較強[23]。但是CO2體積分?jǐn)?shù)增加到0.3‰時，根系活力降低且最低，說明施加的CO2濃度過高反而會引起其根系活力降低。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗根系活力的影響

2.5不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗葉片氣孔特征的影響

如表3和圖4所示，隨著CO2體積分?jǐn)?shù)的升高，紅葉石楠試管苗葉片下表皮細(xì)胞的氣孔密度先升高后降低，CK最小，0.2‰ CO2處理最大，0.3‰ CO2處理的氣孔密度反而降低；CK的氣孔面積較大，氣孔面積隨CO2體積分?jǐn)?shù)的升高呈先降低后升高趨勢，0.2‰ CO2處理最小，而CO2體積分?jǐn)?shù)增加到0.3‰時氣孔面積又呈增大趨勢。表明氣孔密度與氣孔面積呈負(fù)相關(guān)，即氣孔密度越小則氣孔面積越大，反之則相反。

表3 不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗葉片氣孔特征的影響

A.0(CK)； B.0.1‰ CO2； C.0.2‰ CO2； D.0.3‰ CO2圖4 不同體積分?jǐn)?shù)CO2處理下紅葉石楠試管苗葉片的氣孔特征(100×)

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)組培容器由于是密閉環(huán)境，其CO2濃度通常小于大氣中的CO2濃度，相對抑制了容器內(nèi)試管苗的光合作用。Kitaya等[24]發(fā)現(xiàn)，試管苗的光合速率低是因為照光期間容器內(nèi)的CO2濃度處于負(fù)平衡狀態(tài)所導(dǎo)致的。因此，可以通過增加CO2濃度改善組織培養(yǎng)的微環(huán)境，進而提高試管苗的光合自養(yǎng)能力[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，無糖培養(yǎng)條件下，0.2‰ CO2處理的紅葉石楠試管苗除葉幅外其他形態(tài)指標(biāo)(株高、葉數(shù)、葉長、根數(shù)、根長)均優(yōu)于0、0.1‰、0.3‰ CO2處理，說明適宜濃度的CO2可以提高植株的光合能力，促進其生長發(fā)育。0.2‰ CO2處理紅葉石楠試管苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量顯著高于其他處理，但其整株干物率和地上部干物率卻低于CK，這是由于適宜的CO2濃度有利于植物光合作用，生長健壯，生理代謝活動比較旺盛，含水量較高，所以干物率會降低。根部干物率隨著CO2體積分?jǐn)?shù)增加在0.3‰處理達到最大，說明增施CO2可以有效促進植物根部的干物質(zhì)積累。由此可見，外施適宜濃度的CO2能有效促進紅葉石楠試管苗的生長發(fā)育、提高光合作用能力、促進加光合產(chǎn)物的積累，即光合自養(yǎng)能力得到提高。這與Kozai等[25]的研究結(jié)果一致。Ticha等[26]在煙草、Cournac等[27]在馬鈴薯組培苗的研究上也得到類似的結(jié)果。但也有研究表明，組培生長環(huán)境中的CO2濃度過高會對試管苗的光合作用產(chǎn)生相對抑制作用。Mackowiak等[28]發(fā)現(xiàn)，在超高的CO2濃度下，馬鈴薯的光合速率下降，生長停滯，產(chǎn)量減少，且在發(fā)育晚期葉片出現(xiàn)缺氯、畸形等生長發(fā)育不良現(xiàn)象，說明施用CO2濃度超過了植株的CO2濃度飽和點，如果繼續(xù)提高CO2濃度，將會形成高濃度的CO2脅迫微環(huán)境，導(dǎo)致光合作用強度下降。本試驗中也發(fā)現(xiàn)，0.3‰ CO2處理的紅葉石楠試管苗的部分形態(tài)指標(biāo)以及鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量、根系活力等生理指標(biāo)均低于0.2‰ CO2處理，說明過高的CO2濃度也不利于紅葉石楠試管苗的生長，這與Mackowiak等[28]的研究結(jié)論一致。

在不同體積分?jǐn)?shù)CO2對紅葉石楠試管苗葉片氣孔特征的影響方面，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CO2體積分?jǐn)?shù)為0.2‰時，氣孔密度最大，氣孔面積最小，氣孔密度與氣孔面積呈負(fù)相關(guān)，符合植物生理的小孔擴散規(guī)律[29]，即水分子通過小孔擴散的速率與小孔周長呈正比，不與小孔面積呈正比。小孔數(shù)量多，密度大，周長越大，水蒸氣通過氣孔擴散的速率就越快，光合速率越高。但是隨著CO2體積分?jǐn)?shù)增加到0.3‰時，氣孔密度反而降低，單孔面積增大，在氣孔解剖結(jié)構(gòu)水平上也說明了CO2濃度過高抑制了試管苗的光合速率及生長。

綜上所述，當(dāng)紅葉石楠試管苗進行無糖培養(yǎng)時，0.2‰ CO2最有利于提高其產(chǎn)量和質(zhì)量。

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Effect of Different CO2Volume Fraction on the Growth ofPhotiniafraseriPlantletsinVitro

LIU Baoguo1,LI Xiaojuan1,HE Songlin1,2*,WANG Zheng1,SHANG Wenqian1,WANG Huixia1,HE Dan1

(1.College of Forestry,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China；2.Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

In order to improve the quality ofPhotiniafraseriplantletsinvitro,with thePhotiniafraseri‘Red Robin’ plantletsinvitrofor material,we explored the effects of different CO2volume fraction [0(CK),0.1‰,0.2‰,0.3‰]of tissue culture microenvironment on the growth ofPhotiniafraseriplantletsinvitrounder the condition of sugar-free.The results showed that the plant height,leaf number,leaf length,root number,root length,fresh weight,dry weight,chlorophyll index,root activity ofPhotiniafraseriplantletsinvitroall reached the maximum when the CO2volume fraction was 0.2‰.The leaf width was the largest under CK treatment,but there was no significant difference between the treatments; In respect of dry matter rate,the dry matter rate of above-ground ofPhotiniafraseriplantletsinvitrowere decreased with the increase of CO2volume fraction,while the dry matter rate of root was increased with the increase of CO2volume fraction; In terms of stomata,stomata density was negatively correlated with the single hole size and area.The stomata density was the largest and the single hole area were the smallest when the volume fraction of CO2was 0.2‰.In summary,the tissue culture seedling ofPhotiniafraseriwere cultured without sugar and the CO2volume fraction was 0.2‰,which was the most suitable condition for the growth of plantlets.

tissue culture;Photiniafraseri; CO2volume fraction

2017-05-20

國家科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2012D0001018)；河南省產(chǎn)學(xué)研項目(16210700687)；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目(13IRTSTHN005)

劉保國(1975-)，男，河南中牟人，講師，碩士，主要從事風(fēng)景園林植物應(yīng)用研究。E-mail:1152492422@qq.com

*通訊作者：何松林(1963-)，男，河南淮陽人，教授，主要從事園林植物生物技術(shù)研究。E-mail:hsl213@163.com

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： 1004-3268(2017)09-0118-06