楊敬林，李 琳，胡德勇*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2.湖南師范大學(xué) 數(shù)學(xué)與計算機科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081)

長期稻-稻-油菜輪作對土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

楊敬林1，李 琳2，胡德勇1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2.湖南師范大學(xué) 數(shù)學(xué)與計算機科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410081)

為探究南方丘陵地區(qū)稻-稻-油菜輪作對土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，采用常規(guī)土壤農(nóng)化分析和磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法，以安仁縣長期稻-稻-油菜輪作(DDY)和稻-稻連作(DD)土壤為研究對象，比較長期(30 a)DDY和DD處理后3個時期(早稻成熟期、晚稻成熟期、油菜成熟期)土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果表明，DDY處理土壤全氮、全磷含量及pH值均低于DD處理，其中，全氮含量在3個時期均差異顯著，全鉀含量增加但與DD處理差異不顯著，有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量呈動態(tài)變化。輪作對土壤全氮含量影響較大，3個時期DDY處理全氮含量分別較DD處理降低50.76%、46.67%、49.62%。土壤微生物PLFA分析結(jié)果表明，與DD處理相比，DDY處理土壤微生物PLFA總量顯著提高，3個時期分別提高19.69%、20.20%、49.12%，其中，DDY處理土壤細(xì)菌PLFA量顯著增加，真菌PLFA量顯著降低，真菌與細(xì)菌PLFA量比值顯著降低。對土壤微生物PLFA進行主成分分析表明，輪作對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，2種種植方式主要影響土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量?？傊?，長期稻-稻-油菜輪作促進了土壤全氮和全磷的分解，顯著提高微生物生物量，尤其是細(xì)菌生物量，顯著降低真菌生物量，提高兩者的比值。

稻-稻連作； 稻-稻-油菜輪作； 土壤； 微生物群落結(jié)構(gòu)

輪作是指同一塊土地上有計劃地按順序輪種不同類型作物的復(fù)種形式，該栽培措施對改善土壤質(zhì)地、促進作物生長和產(chǎn)量提高具有顯著效應(yīng)[1-3]。水稻和油菜之間隔茬種植在我國長江以南地區(qū)推廣面積較廣。作物生長除了受光照和溫度等自然環(huán)境條件影響外，還受土壤因素影響。土壤中對作物生長影響較大的是養(yǎng)分元素和微生物。養(yǎng)分元素主要包括氮、磷和鉀等營養(yǎng)元素，這些元素是植物生長過程中合成莖、葉的必需元素。微生物是作物根系與土壤之間進行各種生化反應(yīng)的必要條件，例如，在微生物的作用下土壤發(fā)生硝化作用，為作物生長提供能直接吸收利用的硝態(tài)氮。輪作對作物吸收土壤養(yǎng)分以及土壤肥力的影響已有一些報道。蔡艷等[4]研究多種不同類型的旱地作物輪作栽培時發(fā)現(xiàn),輪作提高了土壤養(yǎng)分供給。不同作物輪作對土壤養(yǎng)分的吸收利用不同，對土壤性質(zhì)的影響也不同。土壤微生物與土壤養(yǎng)分之間存在相互作用，微生物的生長所需的碳源和相關(guān)元素來源于土壤，同時微生物又可分解土壤中有機態(tài)碳氮化合物進而增加土壤碳、氮含量[5]。水旱輪作中水稻-棉花、水稻-玉米輪作對土壤中微生物類群活性的增強、種群豐富度的提高均有顯著作用[6]。相關(guān)研究表明，輪作使土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化，不同作物根系釋放物對土壤微生物數(shù)量和種類產(chǎn)生影響[7]。但是土壤中微生物數(shù)量極其龐大，應(yīng)用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法對土壤微生物進行分析存在局限性，采用分子生物標(biāo)記技術(shù)能比較全面地反映微生物的特征，并能對微生物類群進行鑒別。分子生物標(biāo)記技術(shù)常用的方法是磷脂脂肪酸(PLFA)分析法，PLFA是所有活細(xì)胞細(xì)胞膜中磷脂的重要成分，且具有生物學(xué)分類中屬的特異性，通過不同的生化途徑可以形成不同的PLFA[8]。姚欽等[9]進行長期大豆輪作系統(tǒng)定位試驗發(fā)現(xiàn)，輪作增加了土壤細(xì)菌數(shù)量，降低了真菌數(shù)量，并在一定程度上改變了土壤群落結(jié)構(gòu)。目前，關(guān)于長期稻-稻-油菜輪作對土壤理化特性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響研究鮮有報道。為此，以經(jīng)過30 a長期稻-稻-油菜輪作和稻-稻連作的土壤為研究對象，檢測其土壤理化性質(zhì)，并采用PLFA法分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，以期為稻-稻-油菜輪作的實際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗地概況

試驗田位于湖南省安仁縣渡口鄉(xiāng)(26°17′N、113°27′E)，該地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均降雨量為1 000～1 400 mm，年均溫度為15～17 ℃。從1986年開始一直進行稻-稻-冬閑連作和稻-稻-油菜輪作。2種種植方式的施肥量及施肥方式相同。經(jīng)過30 a的定位試驗，選取根際土壤進行研究。

1.2試驗設(shè)計及土樣采集

試驗設(shè)置1 a種植2季水稻即稻-稻連作(DD)處理和1 a種植2季水稻外加冬油菜即稻-稻-油菜輪作(DDY)處理，2個處理均設(shè)3個重復(fù)。試驗小區(qū)面積為3 m×8 m，每個小區(qū)之間通過起壟隔開。于2015年7月、10月和2016年4月，分別在早稻、晚稻和油菜成熟期，按隨機抽樣法從每個試驗小區(qū)布點采集土壤樣品。采樣方式是將整棵水稻或油菜連根拔出后，將穴中土壤裝入無菌自封袋中標(biāo)記為非根際土。抖動拔出后的水稻或油菜植株根系，使附著在根際外圍的土壤散落，選取根際上的土壤放入無菌自封袋標(biāo)記為根際土。

1.3測定項目及方法

1.3.1 土壤基本理化性質(zhì) 土壤全氮、全磷、全鉀、堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質(zhì)含量及pH值參照《土壤農(nóng)化分析》中的方法進行測定[10]。

1.3.2 土壤PLFA量 土壤PLFA的測定和分析參照文獻[8，11]，其具體步驟如下。(1)稱取5.00 g冷凍干燥的土壤樣品于80 mL玻璃離心管中，離心管用鋁鉑紙包住遮光，依次加入4.0 mol/L檸檬酸緩沖液、5.0 mL氯仿和10.0 mL甲醇溶液(氯仿、甲醇、檸檬酸的體積可以改變，只要滿足在單一相萃取中體積比為 1∶2∶0.8即可)。(2)在25 ℃條件下，120 r/min振蕩2 h，然后120 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，并加入4.5 mL氯仿，總體積為25～30 mL，搖動分液漏斗放氣，然后放置在暗處過夜。(3)將下層溶液過濾到包裹鋁鉑紙的茄型瓶中，然后用氯仿沖洗，氮氣吹干。(4)用甲醇將樣品轉(zhuǎn)移到含0.5 g硅膠、上部放有金屬銅粉的分析柱上。(5)依次用5 mL正乙烷、氯仿、丙酮和甲醇洗脫，將甲醇洗脫液收集到包裹鋁鉑紙的10 mL具塞刻度試管中。(6)加入200 μL 19:0脂肪酸甲脂內(nèi)標(biāo)，用氮氣吹干，重新溶于1 mL甲醇和甲苯混合液(比例為1∶1)中，再加入1 mL 0.2 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液，混勻，在37 ℃保持15 min。(7)冷卻至室溫，加入2 mL正乙烷和氯仿混合液(比例為4∶1)、0.3 mL無水乙酸溶液，混勻。最后加入2 mL去離子水，搖勻后靜置分層，保留上清液。(8)再加2 mL正乙烷和氯仿混合液(比例為1∶1)到水相中，合并正乙烷，用氮氣吹干，重新用去離子水定容，充氮氣封口，用氣相色譜儀進行分析。

根據(jù)色譜圖分析，以19：0脂肪酸甲脂作內(nèi)標(biāo)物進行定量計算。特定脂肪酸的命名方法：脂肪酸鏈長以碳原子總數(shù)計算，從羧基開始，冒號后代表雙鍵的數(shù)目，ω后代表雙鍵的位置；c、t表示順式和反式雙鍵，a和i分別指反勢支鏈和順式支鏈，br表示不確定支鍵位置，cy表示環(huán)丙基，Me表示甲基位置。常見的微生物群落PLFA標(biāo)記如表1所示[12-14]。

表1 表征微生物的PLFA

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較，采用Origin 8.0進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1長期稻-稻-油菜輪作對土壤基本理化性質(zhì)的影響

由表2可知，在3個不同測定時期，DDY處理土壤全氮含量顯著低于DD處理，分別較DD處理降低50.76%、46.67%、49.62%；全磷含量和pH值也均低于DD處理，其中全磷含量僅在油菜成熟期差異顯著，pH值差異均不顯著；DDY處理土壤全鉀含量高于DD處理，差異均不顯著；DDY處理有機質(zhì)含量和速效鉀含量在早稻、晚稻成熟期低于DD處理，在油菜成熟期高于DD處理，其中，速效鉀含量3個時期均差異顯著，有機質(zhì)含量在早稻成熟期差異顯著；DDY處理堿解氮含量僅在晚稻成熟期高于DD處理，其余2個時期均低于DD處理，3個時期均差異顯著；DDY處理速效磷含量僅在早稻成熟期高于DD處理，其余2個時期均低于DD處理，差異均顯著。

土壤中全氮 、全磷、全鉀含量能夠反映土壤肥力的總體水平。本研究發(fā)現(xiàn)，輪作主要對土壤全氮含量產(chǎn)生影響，長期稻-稻-油菜輪作促進了土壤中全氮的分解，加快其轉(zhuǎn)化使土壤中全氮含量下降；長期稻-稻-油菜輪作使土壤全磷含量下降，其中在油菜成熟期差異顯著，表明輪作也能加快土壤中全磷的分解和轉(zhuǎn)化使其含量下降；長期稻-稻-油菜輪作對土壤全鉀含量影響較小，3個時期均差異不顯著。土壤有機質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量呈動態(tài)變化，其含量隨作物吸收、土壤養(yǎng)分及有機物的分解而變化。土壤有機質(zhì)含量表現(xiàn)為在油菜成熟期DDY處理高于DD處理，栽種油菜會提高土壤有機質(zhì)含量，這可能與油菜落葉有關(guān)，油菜成熟后葉片凋落在土壤中，凋落物的分解提高了土壤有機質(zhì)含量。pH值反映土壤的酸堿度，長期的輪作栽培會使土壤中的pH值降低。

表2 長期稻-稻-油菜輪作對土壤基本理化性質(zhì)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)。

2.2長期稻-稻-油菜輪作對土壤微生物生物量的影響

土壤微生物PLFA總量反映土壤微生物的生物量。從圖1可知，3個時期，DDY處理PLFA總量均顯著高于DD處理，分別較DD處理提高19.69%、20.20%、49.12%，表明冬季栽種油菜較冬閑田更能有效保持土壤微生物數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，這是因為土壤中微生物生長繁殖除了利用土壤中有機質(zhì)分解產(chǎn)生的碳源和氮源外，根系分泌物也是一類重要的可利用物質(zhì)來源。DDY處理增加了土壤中的根系分泌物，為微生物生長提供更多的物質(zhì)源。

不同字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)，下同圖1 長期稻-稻-油菜輪作對土壤微生物PLFA總量的影響

土壤中微生物主要由細(xì)菌、真菌及一些原生動物和微藻類組成，其中細(xì)菌和真菌對作物生長影響較大。由圖2—3可知，3個時期，DDY處理細(xì)菌PLFA量均顯著高于DD處理，分別較DD處理提高30.43%、31.42%、22.67%，而真菌PLFA量均顯著低于DD處理，分別較DD處理降低13.56%、27.17%、12.21%，表明DDY處理能有效提高土壤細(xì)菌生物量，降低真菌生物量。由圖4可知，DDY處理土壤真菌PLFA量與細(xì)菌PLFA量比值顯著低于DD處理，3個時期分別降低33.73%、44.58%、25.75%，表明稻-稻-油菜輪作能夠有效降低土壤中真菌在微生物中所占的比例，提高細(xì)菌所占比例，這可能是因為輪作條件下不同種類真菌之間會存在一些生物拮抗作用而使其數(shù)量下降；連作栽培有利于真菌在土壤中的積累。

圖2 長期稻-稻-油菜輪作對土壤細(xì)菌PLFA量的影響

圖3 長期稻-稻-油菜輪作對土壤真菌PLFA量的影響

圖4 長期稻-稻-油菜輪作對土壤真菌與細(xì)菌PLFA量比值的影響

2.3長期稻-稻-油菜輪作對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

本研究測定了土壤PLFA同類標(biāo)記物含量，根據(jù)測定結(jié)果對DDY處理和DD處理土壤PLFA同類標(biāo)記物含量進行主成分分析。如圖5所示，第一主成分(PC1)貢獻率為59.26%，第二主成分(PC2)貢獻率為28.33%，這2個主成分的累積貢獻率達87.59%，累積貢獻率超過了85%，能基本解釋數(shù)據(jù)的變異情況。DDY處理數(shù)據(jù)分布點主要落在PC1軸和PC2軸的正方向上，而DD處理數(shù)據(jù)分布點主要落在PC1軸和PC2軸的負(fù)方向上。數(shù)據(jù)點之間距離表示PLFA檢測出的微生物類別相近度，不同處理組數(shù)據(jù)分布點在PC軸上差異明顯，說明不同種植處理形成了不同的微生物類別組成。圖中的散點分布顯示，DDY處理和DD處理間隔較遠(yuǎn)，相同處理的土壤PLFA同類標(biāo)記物主成分分析散點較為集中。PLFA同類標(biāo)記物主成分分析結(jié)果說明，輪作對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯影響，同類種植模式土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)相似。

圖5 不同處理土壤微生物PLFA主成分分析

為進一步分析不同種植方式土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，對DDY處理和DD處理土壤樣品測出的20種典型PLFA進行主成分分析，以3個時期測定的相同類標(biāo)記物含量平均值進行微生物群落載荷因子分析。由圖6可知，對第一主成分起主要作用的是i16：0、16：1ω5、i17：0、i18：1ω5、18：2ω6、18：1ω9，對

第二主成分起主要作用的是10Me16：0、10Me17：0、cy17：0、i17：1ω7、20：3ω6。第一主成分主要由細(xì)菌和真菌構(gòu)成，第二主成分主要由真菌和放線菌構(gòu)成。通過PLFA標(biāo)記的這幾類微生物屬于土壤中的優(yōu)勢菌種，其含量越高對主成分貢獻越大。每類微生物的特定PLFA在主成分中的分布表明，DDY處理和DD處理土壤中的微生物類型以細(xì)菌為主，其次是真菌。

圖6 不同處理土壤微生物PLFA主成分因子載荷

3 結(jié)論與討論

土壤中微生物的數(shù)量及其類別非常復(fù)雜，但每類微生物都有特定的PLFA，通過典型的PLFA標(biāo)記法測定土壤中微生物的屬類和生物量，可以分析土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[12]。PLFA是20世紀(jì)七八十年代發(fā)展起來的微生物測定技術(shù)，該技術(shù)可以對土壤中微生物進行定量分析并鑒定微生物類別。PLFA可以分析土壤中微生物的生物量和各類優(yōu)勢菌群落結(jié)構(gòu)，相比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，具有分析全面、結(jié)果穩(wěn)定和準(zhǔn)確性不易受外界環(huán)境中微生物感染影響等優(yōu)勢[13-15]。陳曉娟等[16]應(yīng)用PLFA分析法研究不同耕地利用方式對土壤微生物各群落生物量的影響發(fā)現(xiàn)，水旱輪作改善了土壤通氣性，真菌/細(xì)菌比值低于稻田和旱地連作。本研究應(yīng)用PLFA分析法對DDY和DD處理土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，在早稻成熟期、晚稻成熟期、油菜成熟期3個時期， DDY處理土壤微生物PLFA總量較DD處理分別顯著提高19.69%、20.20%、49.12%，其中DDY處理土壤細(xì)菌PLFA量顯著增加，真菌PLFA量顯著降低，真菌與細(xì)菌PLFA量比值顯著降低，這與陳曉娟等[16]的研究結(jié)果有相似之處。另外，對土壤微生物PLFA進行主成分分析表明，輪作對微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，影響較大的是細(xì)菌，其次是真菌。水稻油菜輪作土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯高于水稻連作土壤，但其真菌數(shù)量也明顯少于水稻連作土壤。這與邵俊[17]研究不同農(nóng)業(yè)利用下武漢獅子山土壤微生物多樣性的結(jié)論是一致的。

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Effects of Long Term Rice-rice-rape Rotation on Soil Physicochemical Properties and Microbial Community Structure

YANG Jinglin1，LI Lin2，HU Deyong1*

(1.Engineering College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China； 2.College of Mathematics and Computer Science,Hunan Normal University,Changsha 410081,China)

To explore the effect of rice-rice-rape rotation on soil physicochemical properties and microbial community structure in hilly area of southern China,the soil microbial biomass and composition of two kinds of different tillage systems[long rice-rice-rape rotation(DDY) and rice-rice continuous cropping(DD)] after 30 years of rotation were analyzed by PLFA marker spectrum analysis method,and the soil physicochemical properties during three periods(including the mature stages of early rice,late rice and oilseed rape) were studied.The results showed that compared with DD treatment,the contents of total N and total P and pH value of DDY treatment decreased,there was a significant defference for total N content,the total N content of DDY treatment significantly decreased by 50.76%,46.67%,49.62%;the total K content of DDY treatment increased,but the difference was not significant;the contents of organic matter,alkali-hydrolyzable N,available P,available K showed dynamic changes.Soil microbial PLFA marker test showed that compared with DD treatment,soil microbial PLFA amount of DDY treatment increased by 19.69%,20.20% and 49.12% at three different determination stages,respectively;the bacterial PLFA amount of DDY treatment increased,the fungi PLFA amount of DDY treatment decreased,and the ratio of fungi PLFA amount to bacteria PLFA amount of DDY treatment decreased.The principal component analysis of microbial PLFA showed that rotation obviously influenced the microbial community structure,the amount of bacteria and fungi were mainly affected by two tillage methods.Overall,the long term rice-rice-rape rotation promoted the decomposition of total N and P,significantly improved the microbial biomass,especialy bacteria,significantly decreased the fungal biomass,significantly increased the ratio of bacteria to fungi.

rice-rice continuous cropping; rice-rice-rape rotation; soil; microbial community structure

2017-04-10

國家自然科學(xué)基金項目(31401951)

楊敬林(1978-)，男，湖南邵陽人，講師，碩士，主要從事土壤資源環(huán)境方面的研究。E-mail：53835490@qq.com

*通訊作者：胡德勇(1980-)，男，湖南常德人，副教授，博士，主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)與節(jié)水灌溉技術(shù)研究。 E-mail：hdy9609@hunau.net

S154.3

： A

： 1004-3268(2017)09-0045-06