葉元土 吳 萍 蔡春芳 林秀秀 吳代武 何 杰 張寶彤 蕭培珍

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)試驗(yàn)室, 蘇州 215123; 2. 北京營(yíng)養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)研究開(kāi)放試驗(yàn)室, 北京 100000)

在患CyHV-2病的異育銀鯽腸道黏膜中膽固醇、膽汁酸代謝通路基因的差異表達(dá)

葉元土1吳 萍1蔡春芳1林秀秀1吳代武1何 杰1張寶彤2蕭培珍2

(1. 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)試驗(yàn)室, 蘇州 215123; 2. 北京營(yíng)養(yǎng)源研究所水產(chǎn)動(dòng)物系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)研究開(kāi)放試驗(yàn)室, 北京 100000)

為了探討CyHV-2疾病條件下異育銀鯽膽汁酸腸肝循環(huán)代謝途徑主要基因表達(dá)活性的變化, 以患CyHV-2病的、正常的異育銀鯽腸道黏膜為材料, 提取總RNA, 采用RNA-Seq測(cè)序、對(duì)單一基因進(jìn)行注釋, 并進(jìn)行KEGG富集分析、單一基因差異表達(dá)分析。結(jié)果顯示, 腸道黏膜組織有7770個(gè)基因顯著性差異表達(dá), 其中, 差異表達(dá)上調(diào)基因數(shù)為3335個(gè)、差異表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)為4435個(gè), 表明CyHV-2病的發(fā)生對(duì)腸道黏膜組織基因表達(dá)產(chǎn)生了重大的影響。病魚(yú)膽固醇、膽汁酸生物合成代謝途徑的酶、蛋白質(zhì)的基因顯著性差異表達(dá), 顯示腸道黏膜膽固醇、膽汁酸合成代謝受到顯著性影響。參與膽固醇、膽汁酸合成代謝調(diào)節(jié)作用, 以及膽固醇、膽汁酸分泌、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)等生理過(guò)程的蛋白質(zhì)、酶的基因也是差異表達(dá)下調(diào), 膽汁酸腸肝循環(huán)有出現(xiàn)代謝障礙的趨勢(shì)。結(jié)果表明, CyHV-2病的發(fā)生對(duì)腸道黏膜組織基因表達(dá)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響, 對(duì)膽固醇、膽汁酸的合成代謝途徑、膽汁酸腸肝循環(huán)途徑的基因表達(dá)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響, 將導(dǎo)致病魚(yú)體內(nèi)膽固醇、膽汁酸量的不足?；糃yHV-2病病魚(yú)血清膽汁酸含量下降了99%、膽固醇含量下降了10%, 證實(shí)了上述基因差異表達(dá)的趨勢(shì)。

氧化魚(yú)油; 黏膜; 膽固醇; 膽汁酸; 異育銀鯽

油脂是水產(chǎn)動(dòng)物飼料的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量物質(zhì), 而油脂易氧化, 其氧化的中間產(chǎn)物、終產(chǎn)物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有氧化損傷作用[1,2]。在草魚(yú)飼料中添加氧化魚(yú)油[3]或者對(duì)草魚(yú)灌胃氧化魚(yú)油[4], 導(dǎo)致草魚(yú)肝胰臟、腸道黏膜膽固醇生物合成通路基因差異表達(dá), 血清、腸道內(nèi)膽汁酸含量顯著下降; 膽汁酸的腸肝循環(huán)受到嚴(yán)重的障礙, 而膽汁酸的腸肝循環(huán)對(duì)于維護(hù)肝胰臟和腸道組織結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性具有重要的生理作用[4]。異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)受到鯉皰疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)感染后出現(xiàn)全身性出血癥狀, 并導(dǎo)致主要器官組織如肝胰臟、脾臟、腎臟、腸道黏膜、血液等組織嚴(yán)重?fù)p傷; 同時(shí), 病魚(yú)血清的膽固醇和膽汁酸含量顯著下降[5—7]。腸道黏膜是動(dòng)物體內(nèi)代謝活躍的器官組織, 也是膽固醇、膽汁酸合成的重要器官組織之一, 本文分別以正常的、患CyHV-2病的異育銀鯽腸道黏膜為材料, 提取總RNA后采用高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 以正常異育銀鯽的結(jié)果為對(duì)照, 在轉(zhuǎn)錄組水平上, 對(duì)參與膽固醇、膽汁酸生物合成通路的蛋白質(zhì)、酶的基因進(jìn)行功能注釋和差異表達(dá)活性分析, 探討在患CyHV-2病的情況下, 異育銀鯽腸道黏膜組織中膽固醇、膽汁酸合成代謝的酶、蛋白質(zhì)基因表達(dá)活性的變化, 以及參與膽汁酸腸肝循環(huán)的酶、蛋白質(zhì)基因表達(dá)活性的變化, 從一個(gè)側(cè)面、從轉(zhuǎn)錄組水平較為宏觀(guān)的視覺(jué)探討異育銀鯽患CyHV-2病的病理代謝變化, 為該病的病理分析和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

江蘇鹽城大豐市池塘養(yǎng)殖的異育銀鯽。正常魚(yú)無(wú)CyHV-2病發(fā)病特征, 病魚(yú)則是具有CyHV-2病發(fā)病特征、經(jīng)過(guò)PCR定量檢測(cè)帶有CyHV-2病毒的異育銀鯽[5—7]。

參照林秀秀等[5—7]對(duì)異育銀鯽CyHV-2病鑒定方法, 用于血清膽固醇、膽汁酸含量分析的試驗(yàn)魚(yú)包括正常(H)組(CyHV-2的PCR檢測(cè)結(jié)果陰性)、攜帶CyHV-2(CyHV-2的PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性)但未出現(xiàn)病癥(IH)組、典型的CyHV-2病癥(I)組(CyHV-2的PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性)異育銀鯽, 體重為350—510 g,每組各9尾、共27尾。

1.2 血清采集與總RNA提取

按照常規(guī)方法采集正常組(H)、攜帶CyHV-2但無(wú)病癥組(IH)、患CyHV-2病并具有典型病癥組(I)的異育銀鯽血清, 用雅培C800全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清膽固醇和膽汁酸含量。

正常組、患CyHV-2病組異育銀鯽腸道黏膜各9個(gè)樣本(每尾魚(yú)為1個(gè)樣本), 分別用試劑盒(EASYspin Plus)每尾魚(yú)獨(dú)立用于提取總RNA, 電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。正常組、病魚(yú)組分別選取電泳條帶亮度高、清晰、無(wú)拖尾的高質(zhì)量RNA進(jìn)行等量混合, 正常組、病魚(yú)組各1個(gè)樣本(每個(gè)樣本至少有5尾試驗(yàn)魚(yú)的總RNA樣本組成), RNA質(zhì)量約4 μg。同樣方法再混合一個(gè)RNA樣本, 其余的RNA舍棄。正常組、病魚(yú)組分別得到2個(gè)(n=2)平行樣本用于RNA-seq分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

RNA-Seq 樣品總RNA用DNaseⅠ消化DNA后, 用Oligo d (T)磁珠純化總RNA中的mRNA,向得到的mRNA中加入適量打斷試劑, 在高溫條件下使其片段化, 再以片段后的RNA為模板, 合成cDNA, 經(jīng)過(guò)磁珠純化、末端修復(fù)、3'末端加堿基A、加測(cè)序接頭后, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作。構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-Time PCR System質(zhì)檢和測(cè)序。讀段長(zhǎng)度125 bp。

無(wú)參轉(zhuǎn)錄組的轉(zhuǎn)錄本拼接與基因功能注釋

綜上所述，在經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的過(guò)程中，建筑施工企業(yè)想要保障自身的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，必須要對(duì)自身成本管控工作進(jìn)行完善，結(jié)合新時(shí)期發(fā)展趨勢(shì)轉(zhuǎn)變思想觀(guān)念，健全成本管控體制，加強(qiáng)專(zhuān)業(yè)人才培養(yǎng)，完善風(fēng)險(xiǎn)防控，如此才能為成本管控工作的實(shí)施創(chuàng)造良好的條件，為企業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

經(jīng)過(guò)質(zhì)控(QC)、過(guò)濾后得到讀段(clean reads)用Trinity (版本: v2012-10-05, min_kmer_ cov為2)軟件進(jìn)行無(wú)參考基因組的轉(zhuǎn)錄本拼接。

對(duì)拼接好的轉(zhuǎn)錄本利用不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行unigene基因注釋。各數(shù)據(jù)庫(kù)及功能注釋所用到的方法: ①與SwissProt、KOG、KEGG GENES序列數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)采用NCBI blast 2.2.27+, 經(jīng)過(guò)Swissprot注釋得到了38071個(gè)、KOG注釋得到32345個(gè)單一基因。②PFAM蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用HMMER 3.0 package-hmmscan, 經(jīng)過(guò)Pfam注釋得到10227個(gè)單一基因。③GO功能注釋為基于Swissprot和Pfam兩部分的蛋白注釋結(jié)果, 軟件為Blast2GO v2.5, 經(jīng)過(guò)GO注釋得到36838個(gè)單一基因。

基因差異表達(dá)分析與KEGG通路分析 采用RSEM軟件, 以Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列, 將每個(gè)樣品的clean reads對(duì)參考序列做比對(duì)進(jìn)行基因表達(dá)定量。差異表達(dá)分析用edgeR軟件包進(jìn)行分析。對(duì)于所有基因, 當(dāng)其表達(dá)量在正常組、病魚(yú)組兩個(gè)不同樣品間具有差異且統(tǒng)計(jì)分析中調(diào)整P值(假陽(yáng)性率)＜0.05時(shí), 認(rèn)為其在兩個(gè)不同樣品中具有顯著差異表達(dá)。

以KEGG Pathway為單位, 應(yīng)用超幾何檢驗(yàn), 找出與整個(gè)基因組背景相比、在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。以correctedP-value≤0.05為閾值, 滿(mǎn)足此條件的定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的KEGG條目。

2 結(jié)果

2.1 血清膽固醇、總膽汁酸含量

由表 1可知, 異育銀鯽攜帶CyHV-2后, 在IH組、I組, 其血清中膽汁酸和膽固醇含量顯著下降。與正常魚(yú)體的結(jié)果比較, 病魚(yú)血清總膽汁酸含量下降了99%、血清膽固醇含量下降了10%。

表 1 異育銀鯽血清膽固醇和總膽汁酸含量與比較Tab. 1 Gibel carp serum total cholesterol and bile acid content

2.2 基于轉(zhuǎn)錄組分析的基因差異表達(dá)

基于通過(guò)注釋的單一基因結(jié)果, 在正常、患CyHV-2病異育鯽魚(yú)樣本間進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析, 總共有7770個(gè)顯著差異表達(dá)的基因, 其中, 顯著差異表達(dá)上調(diào)基因數(shù)為3335個(gè), 占差異表達(dá)基因總數(shù)的43%; 顯著表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)為4435, 占57%。由表 2可知, 在KEGG類(lèi)固醇合成通路的21個(gè)基因中, 有15個(gè)基因差異表達(dá), 占通路基因總數(shù)的71%;在KEGG初級(jí)膽汁酸合成通路的20個(gè)基因中, 有14個(gè)基因顯著差異表達(dá), 占通路基因總數(shù)的70%;上述2個(gè)KEGG通路差異表達(dá)均達(dá)到顯著性水平(P＜0.05)。上述結(jié)果顯示, 異育銀鯽在患CyHV-2病后, 腸道黏膜組織的基因發(fā)生了顯著性的差異表達(dá),其中膽固醇、膽汁酸的生物合成通路基因也發(fā)生了顯著性的差異表達(dá)。

表 2 基因顯著差異表達(dá)的KEGG路徑富集Tab. 2 Differentially expressed genes of KEGG enrichment

2.3 膽固醇合成通路基因的差異表達(dá)

基于患CyHV-2病與正常的異育銀鯽腸道黏膜轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果, 統(tǒng)計(jì)了膽固醇生物合成途徑有18個(gè)具有差異表達(dá)的基因(表 3)。將注釋得到的單一基因序列, 利用NCBI/ Blast進(jìn)行相對(duì)于不同物種相同基因的同源性分析。表 3中的18個(gè)基因與斑馬魚(yú)、安水金線(xiàn)鲃、犀角金線(xiàn)鲅、滇池金線(xiàn)鲃中相同基因的同源性較高, 同源性達(dá)到78%—100%。

log2(I/H)是將患病組單一基因的表達(dá)量與對(duì)應(yīng)的正常組基因表達(dá)量比對(duì), 進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)值計(jì)算的結(jié)果, 該值越大表明基因表達(dá)量的差異越大,正值為差異表達(dá)上調(diào)、負(fù)值則為差異表達(dá)下調(diào);當(dāng)≥2、或≤–2時(shí)可以視為顯著差異表達(dá)。

表 3 CyHV-2病異育銀鯽腸道黏膜組織膽固醇生物合成通路基因差異表達(dá)信息Tab. 3 Differentially expressed genes of cholesterol biosynthetic pathway in intestinal mucosa

在表 3中, 僅有固醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶1(SOAT1)的log2(I/H)為正值, 且大于2, 表明為顯著差異表達(dá)上調(diào); 其他17個(gè)基因的log2(I/H)值全部為負(fù)值, 表明為差異表達(dá)下調(diào), 其中, 膽固醇生物合成通路關(guān)鍵酶HMG-CoA還原酶等12個(gè)基因的log2(I/H)值小于“–2”, 為差異表達(dá)顯著下調(diào)。

上述結(jié)果表明, 異育銀鯽在患CyHV-2病后, 腸道黏膜組織的膽固醇生物合成通路的絕大多數(shù)基因顯著差異表達(dá)下調(diào), 可能影響到腸道黏膜組織的膽固醇生物合成量的不足。

2.4 膽汁酸合成通路基因的差異表達(dá)

表 4中9個(gè)基因序列相對(duì)于斑馬魚(yú)、安水金線(xiàn)鲃、犀角金線(xiàn)鲅相同基因的同源性為83%—98%。由表 4可知, 參與膽汁酸合成的9個(gè)基因的log2(I/H)值均為負(fù)值, 均為差異表達(dá)下調(diào); 其中, 膽汁酸合成通路關(guān)鍵基因膽固醇7-α單加氧酶(CYP7A1)、固醇26-羥化酶(CYP27A1)等7個(gè)基因的log2(I/H)值小于“–2”, 達(dá)到差異表達(dá)顯著下調(diào)的水平。

表 4 CyHV-2病的異育銀鯽腸道黏膜組織膽汁酸生物合成通路基因差異表達(dá)信息Tab. 4 Differentially expressed genes of bile acid biosynthesis pathway in intestinal mucosa

上述結(jié)果顯示, 在異育銀鯽患CyHV-2病后, 腸道黏膜組織中膽汁酸合成通路的基因差異表達(dá)均為下調(diào), 可能影響到膽汁酸生物合成量的不足, 表明CyHV-2病的發(fā)生將嚴(yán)重影響腸道黏膜組織中膽汁酸生物合成代謝途徑基因的表達(dá)活性。

2.5 參與膽固醇、膽汁酸生物合成代謝調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)、酶基因的差異表達(dá)

表 5 中11個(gè)基因序列相對(duì)于斑馬魚(yú)、安水金線(xiàn)鲃、犀角金線(xiàn)鲅、鯉魚(yú)、草魚(yú)相同基因的同源性為68%—99%。由表 5可知, 涉及膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)的log2(I/H)值為–1.64, 調(diào)節(jié)膽固醇生物合成通路的限速酶HMG-CoA還原酶表達(dá)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBF1、SREBF2)的log2(I/H)值為–2.55、–1.51, 低密度脂蛋白受體(LDLR)的log2(I/H)值為–3.85, 氧固醇受體LXR-α的log2(I/H)值為–1.40, 均為負(fù)值, 顯示在患CyHV-2病后, 這些基因表達(dá)活性下調(diào), 將會(huì)引起腸道黏膜組織膽固醇的生物合成量可能下降。

在涉及膽汁酸分泌、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)中,僅有膽汁酸受體(FXR)的log2(I/H)值為2.63, 為差異表達(dá)上調(diào), 其他的如膽鹽輸出泵(B S E P)的log2(I/H)值為–2.02, 回腸鈉/膽汁酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ASBT)的log2(I/H)值為–8.51, 腸膽汁酸結(jié)合蛋白(IBABP)的log2(I/H)值為–5.63, 肝膽汁酸結(jié)合蛋白(LFABP)的log2(I/H)值為–5.63, 膽汁酸輔酶A(BAAT)的log2(I/H)值為–1.06基因表達(dá)活性均為表達(dá)下調(diào)。

上述結(jié)果表明, 在腸道膽固醇、膽汁酸生物合成通路基因差異表達(dá)下調(diào)的同時(shí), 涉及膽固醇生物合成調(diào)節(jié)、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)基因差異表達(dá)下調(diào), 涉及膽汁酸分泌、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)基因差異表達(dá)下調(diào), 其結(jié)果可能導(dǎo)致膽固醇、膽汁酸生物合成量不足。而血清膽固醇、膽汁酸含量在患Cy-HV-2病后顯著下降, 也證實(shí)了上述結(jié)果。

表 5 參與膽固醇、膽汁酸代謝的蛋白質(zhì)、酶基因的差異表達(dá)信息Tab. 5 Differentially expressed genes of cholesterol, bile acid metabolism

3 討論

3.1 患CyHV-2病的異育銀鯽腸道黏膜組織膽固醇生物代謝通路基因的差異表達(dá)下調(diào)

內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(內(nèi)穩(wěn)態(tài))是動(dòng)物正常生理代謝的基礎(chǔ)。一些生理活性物質(zhì)如膽固醇、膽汁酸在動(dòng)物體內(nèi)保持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定具有重要的生理意義[4,8,9]。膽固醇的來(lái)源包括2個(gè)方面, 一是由體內(nèi)組織細(xì)胞釋放的膽固醇、從食物中攝取并進(jìn)入血液的膽固醇;另一個(gè)來(lái)源則是, 魚(yú)類(lèi)與其他動(dòng)物一樣, 能夠以乙酰CoA為原料合成膽固醇。膽固醇在體內(nèi)不能被徹底氧化分解為CO2和H2O, 而經(jīng)氧化和還原反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌h(huán)戊烷多氫菲母核的化合物, 主要代謝去路包括作為甾醇類(lèi)激素生物合成原料、作為膽汁酸合成的原料、轉(zhuǎn)化為維生素D等[8]。

固醇O-?；D(zhuǎn)移酶(SOAT)又稱(chēng)酰基轉(zhuǎn)移酶(Cholesterol acyltransferase, ACAT), 是細(xì)胞內(nèi)已知的、唯一催化游離膽固醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的酶, 有2種同工酶SOAT1、SOAT2或稱(chēng)ACAT1、ACAT2。SOAT1在各種組織和細(xì)胞中都有表達(dá), 主要作用是催化膽固醇的酯化反應(yīng)、維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝平衡。同時(shí), 有研究表明[10],在血液中的單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞后SOAT1大量表達(dá), 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的過(guò)量堆積而形成泡沫細(xì)胞。林秀秀等在異育銀鯽CyHV-2病研究中發(fā)現(xiàn), 病魚(yú)血液細(xì)胞發(fā)生顯著變化, 產(chǎn)生過(guò)度的炎癥反應(yīng)[5,6,7]。在本文中, 病魚(yú)腸黏膜中SOAT1的 log2(I/H)值為2.29, 是表 3中唯一差異表達(dá)顯著上調(diào)的基因, 這是否與血液?jiǎn)魏思?xì)胞分化為巨噬細(xì)胞有關(guān)值得進(jìn)一步的研究。SOAT2則只在肝臟和小腸細(xì)胞(主要在小腸上皮細(xì)胞絨毛的頂端)中表達(dá), 主要參與膽固醇的吸收以及脂蛋白的裝配。食物來(lái)源的膽固醇是以游離的形式被腸道黏膜細(xì)胞被動(dòng)吸收, 膽固醇進(jìn)入腸黏膜細(xì)胞后受SOAT2催化, 膽固醇與脂酰輔酶A結(jié)合生成膽固醇脂肪酸酯, 并與載脂蛋白組裝為乳糜微粒進(jìn)入淋巴系統(tǒng)或血液系統(tǒng)。病魚(yú)腸黏膜中SOAT2的log2(I/H)值為–4.31, 顯示腸道黏膜細(xì)胞內(nèi)利用膽固醇形成膽固醇酯、組裝為乳糜微粒的SOAT2作用下降。也表明, 從食物、其他細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)的膽固醇量可能不足。在表 5中, 影響膽固醇吸收的低密度脂蛋白受體(LDLR)的log2(I/H)值為–3.85, 影響膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)為–1.64, 顯示均為差異表達(dá)下調(diào), 這些結(jié)果也表明, 異育銀鯽患CyHV-2病后,從其他器官組織吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇能力下降。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇的另一個(gè)主要來(lái)源是以乙酰輔酶A為原料合成膽固醇, HMG-CoA還原酶(HMGCR)是膽固醇生物合成代謝途徑的限速酶, 該酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜整合糖蛋白, 是體內(nèi)膽固醇生物合成的關(guān)鍵酶, 其log2(I/H)值為–6.20, 差異表達(dá)顯著下調(diào)。從表 3也可以發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過(guò)基因注釋、差異表達(dá)分析得知, 膽固醇生物合成途徑的多個(gè)酶蛋白基因均是差異表達(dá)下調(diào)的, log2(I/H)值為(–6.20)—(–0.37)。在表 5中, 參與膽固醇生物合成代謝調(diào)節(jié)作用的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBF1、SREBP-2)的log2(I/H)值為–2.55、–1.51, 也是差異表達(dá)下調(diào)的。

已經(jīng)有研究表明, 在飼料氧化油脂刺激下[3,4],以及草魚(yú)腸道疾病病理?xiàng)l件下[11], 都會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜組織的膽固醇、膽汁酸合成代謝發(fā)生顯著的變化。綜合上述分析可以發(fā)現(xiàn), 異育銀鯽在患CyHV-2病后,一方面顯示膽固醇代謝受到嚴(yán)重影響, 食物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力下降, 以乙酰輔酶A為原料合成膽固醇的能力下降, 參與膽固醇合成代謝起調(diào)節(jié)作用的蛋白、酶的基因表達(dá)活性下降, 可能導(dǎo)致魚(yú)體器官組織、血液中膽固醇含量的不足。病魚(yú)血清中膽固醇含量較正常魚(yú)下降10%也證實(shí)了這種趨勢(shì)。另一方面, 在對(duì)異育銀鯽CyHV-2病進(jìn)行預(yù)防或治療的生產(chǎn)實(shí)踐中,有必要通過(guò)飼料途徑補(bǔ)充一定量的膽固醇, 這值得進(jìn)一步的深入研究和驗(yàn)證。

3.2 患CyHV-2病的異育銀鯽腸道黏膜組織膽汁酸代謝通路基因差異表達(dá)下調(diào)

以膽固醇為原料合成膽汁酸有2種途徑[8,9]: 經(jīng)典途徑和替代途徑。經(jīng)典途徑是由膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)催化, CYP7A1是此反應(yīng)的限速酶; 替代途徑是由甾醇27α羥化酶(CYP27A1)和甾醇12α羥化酶(CYP7B1)催化的途徑。膽固醇7-α單加氧酶(CYP7A1)是以膽固醇為原料合成膽汁酸代謝經(jīng)典途徑的限速酶, 膽汁酸的合成速度與CYP7A1的活性呈正相關(guān)關(guān)系, 決定了膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化的速度[3,4]。由表 4可知, CYP7A1的log2(I/H)值為–7.35, 顯示其差異表達(dá)顯著下調(diào)。代謝途徑中后續(xù)的膽汁酸合成代謝酶的log2(I/H)值均為負(fù)值, 顯示膽汁酸合成路徑的催化酶基因差異表達(dá)均為下調(diào)。CYP7A1的活性和表達(dá)量受固醇受體(LXR-α)的調(diào)節(jié), 而LXR-α的log2(I/H)值為–1.40, 也是差異表達(dá)下調(diào)。由表 4可知, 膽汁酸合成替代途徑有甾醇27α羥化酶(CYP27A1) log2(I/H)值為–3.46、甾醇12α羥化酶(CYP7B1) log2(I/H)值為–5.76, 也是差異表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果表明, 無(wú)論是經(jīng)典途徑或是替代途徑, 膽汁酸合成途徑的限速酶、參與催化代謝途徑的酶, 其基因差異表達(dá)均為下調(diào)。

關(guān)于膽汁酸的分泌、重吸收途徑, 膽汁酸在肝臟合成后由膽鹽輸出泵(BSEP)泵入腸道, 游離膽汁酸在腸道由黏膜細(xì)胞通過(guò)擴(kuò)散作用被動(dòng)重吸收, 而結(jié)合膽汁酸通過(guò)小腸刷狀緣的鈉鹽依賴(lài)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(ASBT)被黏膜細(xì)胞主動(dòng)重吸收, 黏膜細(xì)胞內(nèi)的膽汁酸與回腸膽汁酸結(jié)合蛋白(IBABP)結(jié)合, 由黏膜基側(cè)膜吸收入靜脈、回到肝胰臟, 完成膽汁酸的腸肝循環(huán)[8,9]。在表 5中, BSEP的log2(I/H)值為–2.02, 顯示涉及膽汁酸分泌的蛋白質(zhì)基因差異表達(dá)顯著下調(diào)。ASBT、腸膽汁酸結(jié)合蛋白(I-BABP)、肝膽汁酸結(jié)合蛋白(L-FABP)的log2(I/H)值分別為–8.51、–7.37、–5.63, 顯示涉及膽汁酸重吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的基因表達(dá)活性也是顯著性下調(diào), 膽汁酸有在肝胰臟淤積的發(fā)展趨勢(shì)。這些結(jié)果顯示, 患CyHV-2病后, 異育銀鯽膽汁酸的分泌、膽汁酸的腸肝循環(huán)途徑中主要蛋白質(zhì)基因的表達(dá)活性也發(fā)生了顯著性變化, 均為顯著性下調(diào), 可能導(dǎo)致膽汁酸的腸肝循環(huán)障礙。病魚(yú)血清膽汁酸含量下降99%也證實(shí)了這種趨勢(shì)。

膽汁酸受體(FXR)是膽汁酸的感受器, 屬于核受體, 受FXR調(diào)控的靶基因主要有CYP7A1、BSEP、IBABP等。當(dāng)膽汁酸濃度過(guò)大時(shí), 使CYP7A 1轉(zhuǎn)錄受到抑制, 膽汁酸合成速度下降。由表 4、表 5可知, FXR、CYP7A1、BSEP、IBABP的log2(I/H)值分別為2.63、–7.35、–2.02、–7.37, 結(jié)果顯示, 即使FXR差異表達(dá)顯著上調(diào), 但其下游涉及膽汁酸合成、重吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)基因還是差異表達(dá)顯著下調(diào)。

上述結(jié)果表明, 異育銀鯽在患CyHV-2病后, 腸道黏膜組織膽汁酸生物合成代謝能力下降, 可能導(dǎo)致膽汁酸含量的不足。膽汁酸的分泌、重吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)基因差異表達(dá)下調(diào), 可能導(dǎo)致膽汁酸的腸肝循環(huán)障礙。病魚(yú)血清總膽汁酸含量下降99%也證實(shí)了這種發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)于異育銀鯽Cy-HV-2病的預(yù)防、治療, 以及病后魚(yú)體生理健康的恢復(fù), 通過(guò)飼料途徑補(bǔ)充適量膽汁酸可能具有可行性, 值得進(jìn)一步的研究。

[1]Ye Y T, Cai C F, Wu P. Injury of Oxidized Dietary Oil on Growth and Health of Grass Carp [M]. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press. 2015, 137—625 [葉元土, 蔡春芳, 吳萍. 氧化油脂對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)和健康的損傷作用. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社. 2015, 137—625]

[2]Chen K Q, Ye Y T, Cai C F, et al. Effects of dietary oxidizes fish oil on growth and muscle fatty acid composition of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) [J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27(6): 1698—1708 [陳科全, 葉元土, 蔡春芳, 等. 飼料中氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)生長(zhǎng)及肌肉脂肪酸組成的影響. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2015, 27(6): 1698—1708]

[3]Huang Y W, Ye Y T, Cai C F, et al. The effect of cholesterol and bile acid metabolism synthesis pathway related enzymes in the liver and intestine under oxidized fish oil in Ctenopharyngodon idellus [J]. Genomics and Applied Biology, 2015, 34(8): 1636—1646 [黃雨薇, 葉元土, 蔡春芳, 等. 氧化魚(yú)油對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝的影響. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2015, 34(8): 1636—1646]

[4]Ye Y T, Cai C F, Xu F, et al. Feeding grass carp (Ctenopharyngodon idellus) with oxidized fish oil up-regulates the gene expression in the cholesterol and bile acid synthesis pathway in intestinal mucosa [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(1): 90—100 [葉元土, 蔡春芳, 許凡, 等. 灌喂氧化魚(yú)油使草魚(yú)腸道黏膜膽固醇膽汁酸合成基因通路表達(dá)上調(diào). 水生生物學(xué)報(bào), 2015, 39(1): 90—100]

[5]Lin X X, Ye Y T, Wu P, et al. The injury effect of infection by cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) on tissues and organs of gibel carp (Carassius auratus gibelio) [J]. Genomics and Applied Biology, 2016, 35(3): 587—594 [林秀秀, 葉元土, 吳萍, 等. 鯉皰疹Ⅱ型病毒(CyHV-2)感染對(duì)異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)組織器官的損傷作用. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(3): 587—594]

[6]Lin X X, Ye Y T, Wu P, et al. Ultra-pathological observation of cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2) of a gibel carp (Carassius auratus gibelio) with hematopoietic necrosis [J]. Chinese Journal of Fisheries, 2016, 29(1): 17—23 [林秀秀, 葉元土, 吳萍, 等. 異育銀鯽造血器官壞死癥病魚(yú)體內(nèi)鯉皰疹病毒Ⅱ型的電鏡觀(guān)察與超微病理學(xué)特征.水產(chǎn)學(xué)雜志, 2016, 29(1): 17—23]

[7]Lin X X, Ye Y T, Wu P, et al. Variation in blood biochemical indices and histopathology in gibel carp (Carassius auratus gibelio) Infected with cyprinid herpesvirus Ⅱ [J]. Chinese Journal of Fisheries, 2016, 29(2): 16—23 [林秀秀, 葉元土, 吳萍, 等. 感染鯉皰疹病毒Ⅱ型 (CyHV-2) 的異育銀鯽血液生理生化指標(biāo)及相應(yīng)組織學(xué)變化. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2016, 29(2): 16—23]

[8]Zhang J C, Nie Q H. Metabolism of bile acid and related diseases progression [J]. China Journal Gastroenterology and Hepatology, 2008, 17(11): 953—956 [張久聰, 聶青和. 膽汁酸代謝及相關(guān)進(jìn)展. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2008, 17(11): 953—956]

[9]Zhang L, Niu S M. The progress of bile acids and metabolic syndrome [J]. Medical Recapitulate, 2016, 22(5): 964—967 [張柳, 牛尚梅. 膽汁酸與代謝綜合征的研究進(jìn)展. 醫(yī)學(xué)綜述, 2016, 22(5): 964—967]

[10]Yao X M, Song B L, Wang C H, et al. Human Acyl-coenzyme A: cholester of Aacyltr ansfer ase (ACAT) [J]. Journal of Shanghai Jiaotong University (Agricultural Science), 2006, 24(1): 108—115 [姚曉敏, 宋保亮, 王燦華, 等. 人酰基輔酶A: 膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT). 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào) (農(nóng)業(yè)科學(xué)版), 2006, 24(1): 108—115]

[11]Huang Y W, Ye Y T, Cai C F, et al. The effect of the gene expression in metabolism of cholesterol synthesis pathway after intestine injuried on Ctenopharyngodon idellus [J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2015, 38(3): 497—503 [黃雨薇, 葉元土, 蔡春芳, 等. 腸道損傷對(duì)草魚(yú)膽固醇代謝通路基因表達(dá)的影響. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 38(3): 497—503]

GENE DIFFERENCE EXPRESSION OF CHOLESTEROL AND BILE ACID METABOLISM PATHWAY IN INTESTINAL MUCOSA WITH THE CYHV-2 DISEASE CARASSIUS AURATUS GIBELIO

YE Yuan-Tu1, WU Ping1, CAI Chun-Fang1, LIN Xiu-Xiu1, WU Dai-Wu1, HE Jie1, ZHANG Bao-Tong2and XIAO Pei-Zhen2
(1. Key Laboratory of Aquatic Animal Nutrition, School of Basic Medicine and Biological Science, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Open Lab for Aquatic Animal Nutrition, Beijing Research Institute for Nutritional, Beijing 100000, China)

Gibel carp (Carassius auratus gibelio) infected with Cyprinid herpesvirus 2 (CyHV-2), damaged many organs including intestinal mucosa. Total RNA of intestinal mucosa from CyHV-2 diseased and normal gibel carp were extracted for RNA-Seq. Transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome was conducted by Trinity (version: v2012-10-05, min_kmer_cov 2) software. Single gene is annotated by using different databases. Software and the database of the functional gene annotation are SwissProt (NCBI blast 2.2.27+, Blast2GO v2.5), KOG (NCBI blast 2.2.27+), PFAM (HMMER 3.0 package), KEGG (KOBAS, NCBI blast 2.2.27+). Gene expression was analyzed by edgeR package. 3335 up-regulated genes and 4435 down-regulated genes were observed, indicating a significant injury in the intestinal mucosa by CyHV-2 infection. The metabolic disorder for enterohepatic circulation of bile acids was supported by the reduced gene expression that regulate cholesterol and bile acid synthesis metabolism and other physiological processes, secretion, absorption and transportation. As a consequence, CyHV-2 infection in Crucian carp decreased the serum bile acid content by 99% and cholesterol content by 10%.

Oxidized fish oil; Mucosa; Cholesterol; Bile acid; Gibel carp

S917

A

1000-3207(2017)05-0956-07

10.7541/2017.119

2016-09-07;

2016-12-24

江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目(D2015-12)資助 [Supported by the Jiangsu Province, Three New Aquatic Projects (D2015-12) Funding]

葉元土, 教授, 碩士生導(dǎo)師, E-mail: yeyt@suda.edu.cn, Tel./Fax: +86-13912629760