劉益臻，馬武開(kāi)，何 康，梁 江，孫李萍，陳斌斌，付坤飛

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴陽(yáng) 550001；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,貴陽(yáng) 550003)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

尪痹片對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠骨髓RhoA和ROCK1的影響*

劉益臻1，馬武開(kāi)2，何 康1，梁 江2，孫李萍2，陳斌斌1，付坤飛1

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴陽(yáng) 550001；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,貴陽(yáng) 550003)

目的 探討尪痹片對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠骨髓細(xì)胞懸液RhoA、ROCK1的影響。方法 雄性昆明小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、尪痹片組、仙靈骨葆組、甲氨蝶呤組，每組10只。構(gòu)建小鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型，給藥28 d后取小鼠骨髓細(xì)胞懸液，檢測(cè)RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、RhoA、ROCK1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 模型組的RhoA mRNA(1.96±0.02)、ROCK1 mRNA(2.22±0.01)、RhoA蛋白(0.36±0.02)、ROCK1 蛋白(0.61±0.02)均較空白組有明顯升高;尪痹片組的RhoA mRNA(0.68±0.02)、ROCK1 mRNA(1.21±0.03)均低于模型組和仙靈骨葆組，同時(shí)RhoA蛋白(0.66±0.03)、ROCK1 蛋白(1.18±0.03)表達(dá)均高于其他各組。結(jié)論 尪痹片抑制關(guān)節(jié)炎癥的機(jī)制可能與下調(diào)骨髓中某些細(xì)胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相關(guān)，增加骨密度的機(jī)制可能與上調(diào)骨髓中某些細(xì)胞RhoA蛋白、ROCK1 蛋白相關(guān)。

關(guān)節(jié)炎；小鼠；骨髓；尪痹片；RhoA；ROCK1

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的主要病理變化包括關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、關(guān)節(jié)軟骨及骨組織破壞。尪痹片為中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)風(fēng)濕病分會(huì)協(xié)定處方，臨床用于治療RA療效顯著，病理研究和臨床研究均表明該藥可減輕骨破壞程度,促進(jìn)骨形成[1-2]，但其作用分子機(jī)制尚不十分明確。本研究旨在探討尪痹片阻止炎癥,促進(jìn)骨形成的可能分子靶點(diǎn)。

骨形成的重要細(xì)胞為成骨細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞[3]，細(xì)胞骨架的改變與細(xì)胞的分化密切相關(guān)[4]，RhoA/ROCK信號(hào)通路在細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用,阻斷該信號(hào)通路，可以抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[5]。因此推測(cè)尪痹片可能通過(guò)影響骨髓中細(xì)胞的RhoA/ROCK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的生成，故初步選取RhoA、ROCK蛋白及其mRNA的表達(dá)探討這一假設(shè)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 尪痹片(遼寧上藥好護(hù)士藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào):160101),仙靈骨葆膠囊(貴州同濟(jì)堂制藥有限公司，批號(hào)：1505023)，甲氨蝶呤片(上海信宜藥廠有限公司，批號(hào)：036151101),一步法快速WB(HRP)試劑盒(康為世紀(jì) 鼠CW2030，兔CW2029)，高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(康為世紀(jì)CW0049C)，蛋白膜印跡再生液(康為世紀(jì) CW0056)，TRNzol總RNA提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：DP405-02]，PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，批號(hào)：RR047B)，SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ (Tli RNaseH Plus),ROX plus(TaKaRa，批號(hào)：RR82LR)，DL2 000 DNA Marker(TaKaRa，批號(hào)：3427Q)，康為世紀(jì)SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CW0022)，弗氏完全佐劑(Sigma,批號(hào)：1001646446)。

1.2 動(dòng)物及造模方法[6]清潔級(jí)雄性昆明小鼠50只，體質(zhì)量(20±5)g，重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。25 ℃恒溫條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由取食、飲水。將50只小鼠隨機(jī)分為5組，即空白組、模型組、尪痹片組、仙靈骨葆組、甲氨蝶呤組，每組10只。將弗氏完全佐劑-蒸餾水體積比1∶1混合均勻并充分乳化后，用微量注射器于模型組、尪痹片組、仙靈骨葆膠囊組，甲氨蝶呤組小鼠右后足跖內(nèi)注射0.02 mL?？瞻捉M小鼠右后足跖內(nèi)注射等劑量生理鹽水。

1.3 儀器 164-5050電泳儀(BIO-RAD)，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽(BIO-RAD)，Mini Trans-Blot 蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(BIO-RAD)，TY-80脫色搖床(江蘇金壇)，ZS-2板式酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)機(jī)電),202-2AB電熱恒溫箱(天津泰斯特),TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湘儀貝克)，QL-902渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，Centrifuge 5415D離心機(jī)(Eppendorf)，NANODROP 2000分光光度計(jì)(Therno scientific)，Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.4 分組及給藥 將小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組。按照文獻(xiàn)造模7 d后開(kāi)始灌胃給藥，劑量為以上藥物的人臨床等效劑量的3倍，尪痹片組(120 mg/kg，1次/天)，仙靈骨葆膠囊組(90 mg/kg，1次/天)，甲氨蝶呤組(0.6 mg/kg，1次/周)，藥物均用生理鹽水稀釋后給予灌胃，空白組和模型組均給予相同體積的蒸餾水。給藥28 d后取材。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡2～3 min，分離小鼠兩側(cè)股骨和脛骨及其所附肌肉，將分離好的股骨和脛骨放到一個(gè)裝有3～4 mL生理鹽水的培養(yǎng)皿中。將股骨和脛骨分別從中間剪斷(或者兩端剪掉)，露出骨髓腔，用1 mL注射器吸入生理鹽水反復(fù)沖洗骨髓腔，將沖洗后的細(xì)胞懸液移到離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，-80 ℃冰箱保存。

1.5.1 實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各組小鼠骨髓細(xì)胞中的RhoA、ROCK1的mRNA表達(dá) 采用TRNzol總RNA提取試劑進(jìn)行樣本RNA提取，紫外吸收測(cè)定法檢測(cè)RNA的濃度和純度，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，GenBank中查找到小鼠 GAPDH 內(nèi)參和RhoA、ROCK1的mRNA序列。引物由北京Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成(表1) 。PCR 按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，各樣品的目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.5.2 Western blot法檢測(cè)各組小鼠骨髓細(xì)胞懸液中RhoA、ROCK1蛋白的表達(dá) 取5組小鼠鼠骨髓細(xì)胞，進(jìn)行組織低溫勻漿、裂解，提取總蛋白，用BCA法粗略測(cè)定蛋白濃度后，然后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，加5%脫脂奶粉封閉液，室溫下平搖 1 h;洗膜，加一抗稀釋液，4 ℃ 過(guò)夜孵育;洗膜， 加二抗稀釋液室溫孵育 1 h，洗膜后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。曝光、顯影、定影，最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組骨髓組織RhoA mRNA、ROCK1 mRNA比較 與空白組比較，模型組的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA有明顯升高(P<0.01)，分別為空白組的1.96倍和2.22倍；與模型組比較，各組ROCK1 mRNA均有明顯降低(P<0.01)，其中以尪痹片組降低最為明顯；與模型組比較，各組RhoA mRNA均有明顯降低(P<0.01)，其中以甲氨蝶呤組最為明顯；尪痹片組與仙靈骨葆組相比，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尪痹片組與甲氨蝶呤組相比，ROCK1 mRNA的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組骨髓細(xì)胞懸液RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達(dá)比較

設(shè)空白組RhoA mRNA和ROCK1 mRNA表達(dá)均為1；a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與甲氨蝶呤組比較；d：P<0.01，與仙靈骨葆組比較

表3 各組骨髓細(xì)胞懸液的RhoA 、ROCK1蛋白表達(dá)比較

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與甲氨蝶呤組比較；d：P<0.01，與仙靈骨葆組比較

2.2 各組骨髓細(xì)胞懸液RhoA、ROCK1蛋白比較 與空白組比較，模型組的RhoA、ROCK1蛋白有明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，僅有尪痹片組的ROCK1蛋白有明顯升高(P<0.01)，尪痹片組和仙靈骨葆組的RhoA蛋白均有明顯升高(P<0.01)。尪痹片組與仙靈骨葆組相比，RhoA、ROCK1蛋白差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，尪痹片組與甲氨蝶呤組相比，RhoA、ROCK1蛋白的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3和圖1。

A：空白組；B：模型組；C：仙靈骨葆組；D：甲氨蝶呤組；E：尪痹片組

圖1 各組RhoA 、ROCK1蛋白灰度值比較

3 討 論

研究表明RA患者的骨髓細(xì)胞存在異常，如活動(dòng)性RA患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)出現(xiàn)分化發(fā)育能力下降和凋亡加速[7-8]，BMSCs向成骨分化中細(xì)胞骨架系統(tǒng)將發(fā)生改變[9-10];有研究直接證明了細(xì)胞骨架張力和RhoA的表達(dá)能主導(dǎo)BMSCs的分化[11-12]。RhoA對(duì)干細(xì)胞的自我更新和成骨發(fā)育也起著“開(kāi)關(guān)”作用，RhoA/ROCK信號(hào)通路被稱為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)器，活化的RhoA依次與效應(yīng)蛋白分子(ROCK1/2、mDia、PRK1 2、citron激酶)等結(jié)合，從而開(kāi)啟下游的信號(hào)通路[13]。然而，大量研究顯示，RhoA/ROCK通路不僅對(duì)不同細(xì)胞發(fā)揮著不盡相同的調(diào)節(jié)能力，甚至在同一細(xì)胞的不同生理病理狀態(tài)下亦有不同的表達(dá)形式和功能，RhoA的表達(dá)和ROCK的表達(dá)存在著不平行現(xiàn)象[14]，這種重要性和異質(zhì)性使得研究該通路具有非常重要的意義甚至帶有一定的趣味性。

有關(guān)尪痹片臨床療效的研究較多[2]，但是對(duì)其療效作用分子機(jī)制的研究尚處于起步階段。綜上所述，推測(cè)尪痹片療效的深層分子機(jī)制很有可能在于調(diào)節(jié)骨髓中的RhoA/ROCK通路。甲氨蝶呤作為RA的基石用藥，小劑量亦發(fā)生骨髓抑制[15]；仙靈骨葆膠囊在“腎主骨生髓”的理論基礎(chǔ)和“補(bǔ)肝腎”的治法上與尪痹片相似，某些藥物相同，如淫羊藿、續(xù)斷、知母、地黃。那么這些藥物是否都能影響關(guān)節(jié)炎小鼠骨髓細(xì)胞的RhoA/ROCK通路呢？

在這些問(wèn)題的指引下，對(duì)這幾種藥物進(jìn)行了初步研究,觀察是否能對(duì)RhoA、ROCK1 產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、RhoA蛋白、ROCK1 蛋白均較空白組有明顯升高，但是3個(gè)給藥組的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA均較模型組低，給藥組中仙靈骨葆組的表達(dá)量較其他兩組高。從RhoA蛋白、ROCK1 蛋白表達(dá)來(lái)看，尪痹片組的表達(dá)較其他各組高，甲氨蝶呤組組與模型組的表達(dá)沒(méi)有差異(P>0.05);仙靈骨葆組的RhoA蛋白表達(dá)較模型組低(P<0.01)，但是ROCK1蛋白與模型組沒(méi)有差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，在關(guān)節(jié)炎癥狀態(tài)下，關(guān)節(jié)炎小鼠的骨髓細(xì)胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA會(huì)發(fā)生高表達(dá)，在藥物的干預(yù)下，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達(dá)均降低，提示這兩個(gè)分子在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，眾所周知，甲氨蝶呤和尪痹片在抑制關(guān)節(jié)炎癥方面療效顯著，本研究中甲氨蝶呤和尪痹片可顯著降低RhoA mRNA、ROCK1 mRNA，推測(cè)骨髓中某種細(xì)胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA可能參與了關(guān)節(jié)炎癥的某些信號(hào)通路。

從RhoA蛋白、ROCK1 蛋白的表達(dá)來(lái)看，其表達(dá)與mRNA的表達(dá)不平行，尪痹片對(duì)RhoA蛋白、ROCK1 蛋白的表達(dá)較其他組顯著升高。RA主要為炎癥性關(guān)節(jié)病，但是又以伴發(fā)骨代謝異常骨質(zhì)疏松癥為特點(diǎn)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍骨丟失及骨侵蝕、全身性骨質(zhì)疏松癥,患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[16]。骨質(zhì)疏松的原因之一在于骨生成不足[17]。有報(bào)道稱尪痹片可以增加RA患者的骨密度以及骨鈣素、血清Ⅰ型膠原交聯(lián) C 末端肽等血清成骨標(biāo)志物。甲氨蝶呤并不能阻止骨質(zhì)疏松的發(fā)生[18]，推測(cè)骨髓中某些細(xì)胞的RhoA蛋白、ROCK1 蛋白可能在關(guān)節(jié)炎小鼠的骨形成中起一定的作用。尪痹片很有可能通過(guò)上調(diào)骨髓中某些細(xì)胞的RhoA蛋白、ROCK1 蛋白來(lái)起到促進(jìn)骨形成的作用。此外，尪痹片與仙靈骨葆膠囊雖然在立方依據(jù)、功效及藥物上有相似之處，但是在對(duì)ROCK1和RhoA的影響方面有較大區(qū)別，因而兩種藥物在治療關(guān)節(jié)炎方面的分子機(jī)制不同，還應(yīng)進(jìn)一步研究。

綜上所述，骨髓中具有不同類型的細(xì)胞，關(guān)節(jié)炎小鼠的不同骨髓細(xì)胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、RhoA蛋白、ROCK1 蛋白在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中的作用可能不相同，尪痹片抑制關(guān)節(jié)炎癥的機(jī)制可能與下調(diào)骨髓中某些細(xì)胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相關(guān)，增加骨密度的機(jī)制可能與上調(diào)骨髓中某些細(xì)胞RhoA蛋白、ROCK1 蛋白相關(guān)。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.033

貴州省科學(xué)技術(shù)廳課題(黔科合J字[2015]2024)。 作者簡(jiǎn)介:劉益臻(1981-)，副教授,博士，主要從事中醫(yī)及民族醫(yī)藥治療風(fēng)濕病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

R285.5

B

1671-8348(2017)22-3125-03

2017-02-22

2017-04-16)