李樹斌，蘇冬梅

中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)內(nèi)1科，北京102618

結(jié)腸癌患者外周血Th17和Th22細胞分布及IL-17A和IL-22的作用研究

李樹斌，蘇冬梅

中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)內(nèi)1科，北京102618

目的 研究結(jié)腸癌患者外周血Th17和Th22亞群分布及血清IL-17A和IL-22含量與臨床病理的相關(guān)性及IL-17A和IL-22對結(jié)腸癌細胞的作用。方法 收集結(jié)腸癌患者全血和血清樣本，流式細胞術(shù)檢測Th17和Th22亞群比例;ELISA法檢測血清細胞因子IL-17A和IL-22含量;流式細胞術(shù)檢測IL-17A和IL-22對結(jié)腸癌細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果 結(jié)腸癌患者外周血Th17和Th22含量較健康對照組顯著升高;血清IL-22表達水平顯著升高;IL-17A和IL-22促進結(jié)腸癌細胞增殖，抑制細胞凋亡。結(jié)論Th17和Th22細胞及其相關(guān)細胞因子與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

結(jié)腸癌;Th22細胞;IL-22;Th17細胞;IL-17A

結(jié)腸癌是高發(fā)腫瘤，尤其在中國，近年來結(jié)腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢。雖然伴隨著結(jié)腸癌的篩查和早期診斷及治療方法的不斷改進，結(jié)腸癌患者的總體生存率已大大提高。但是晚期結(jié)腸癌的死亡率依然很高。因此，深入研究結(jié)腸癌的分子機制有助于提高診斷和治療效果［1］。

越來越多的證據(jù)表明，淋巴細胞亞群分布和細胞因子表達水平失調(diào)與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。Th17細胞是一個CD4+T淋巴細胞亞群 (主要分泌IL-17A)，廣泛參與多種自身免疫性疾病和慢性炎癥。目前對于小鼠和人類的Th17細胞的分化和功能研究已取得了可喜的進展，但在腫瘤特別是結(jié)腸癌中Th17細胞的產(chǎn)生和調(diào)控仍有許多問題不明確［4］。Th22細胞是分泌IL-22的一類CD4+輔助性T細胞。這類細胞在炎癥和自身免疫性疾病中的功能特點也已被廣泛研究。但是其在腫瘤免疫中的作用研究相對有限，特別是在結(jié)腸癌中［5］。本研究通過檢測并分析結(jié)腸癌患者外周血Th17和Th22細胞與相關(guān)細胞因子的表達差異及與臨床病理的相關(guān)性，旨在探討Th17和Th22細胞在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床個體化治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院2014年12月-2015年12月經(jīng)病理確診的結(jié)腸癌患者外周血和血清樣本53例，男33例，女20例，年齡38～81歲，平均年齡60歲;TNM分期StageⅠ～Ⅱ23例，StageⅢ～Ⅳ30例;患者均接受手術(shù)治療，在未開始放化療或免疫治療之前取樣。入組患者排除自身免疫性疾病、傳染病、多發(fā)性原發(fā)癌、腸炎和家族性息肉。健康對照來自我院體檢人群，共50名，男23名，女27名，年齡(57±6.21)歲(40～75歲)。血液樣本的流式檢測在24 h內(nèi)完成，血清樣本保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I、Anti-humanCD3-PerCP、CD4-FITC/APC、CD8-FITC/APC、IL-17A-PE抗體和相應(yīng)同型對照購自BD Bioscience。Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)，ionomycin，Brefeldin A，F(xiàn)IX ＆ PERM Kit Reagent、Anti-human IL-22-PE抗體、IL-17A和 IL-22 ELISA kit購自 eBioscience。

1.3 流式檢測 細胞表面染色按試劑說明操作，室溫避光孵育20 min;胞內(nèi)染色時細胞 (1×106)被刺激培養(yǎng)4 h 用50 ng/ml PMA、1 μg/ml ionomycin、10 μg/ml Brefeldin A，染色前細胞用FIX＆PERM Kit破膜和固定。實驗使用FACSCalibur流式細胞儀檢測，CellQuest software分析數(shù)據(jù)。

1.4 ELISA法檢測結(jié)腸癌患者血清IL-17A、IL-22表達水平 按說明書操作，酶標儀檢測(490 nm)。

1.5 細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞系HT-29購自中國科學(xué)院細胞庫。Recombinant human IL-17A、IL-22購自PeproTech Company。細胞常規(guī)培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，輔以100 g/L FBS。待進入指數(shù)期后，分別加入IL-17A(50 ng/ml)和IL-22(50 ng/ml)。48 h后收集細胞，進行胞內(nèi)Ki-67染色，Annexin V和PI染色檢測細胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0和SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用Student’s t-test、a paired t-test和one-way ANOVA。外周血清細胞含量用±s表示，流式檢測外周血Th22及Th17細胞比例用中位數(shù)(P25，P75)表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者外周血Th22、Th17細胞顯著增加流式檢測結(jié)果顯示，與健康對照組［1.20%(0.91%，1.51%)］相比，結(jié)腸癌患者的CD4+T細胞中Th17細胞顯著增加［3.00%(1.90%，5.00%)，P ＜0.0001］。晚期結(jié)腸癌(StageⅢ～Ⅳ)患者的Th17細胞含量高于早期患者 (StageⅠ～Ⅱ)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (見圖1A～1B)。與健康對照組［1.68%(1.31%，2.67%)］相比，結(jié)腸癌患者的CD4+T細胞中Th22細胞顯著增加［(2.70%(1.70%，4.70%)，P=0.0010)］;晚期結(jié)腸癌患者的Th22細胞含量(StageⅢ～Ⅳ)［3.25%(2.40%，6.15%)］高于早期患者 (StageⅠ～Ⅱ)［2.00%(1.45%，3.10%)，P=0.0478］(見圖1C ～1D)。

圖1 結(jié)腸癌患者外周血CD4+T細胞中Th17和Th22細胞亞群分布 A:結(jié)腸癌患者和健康對照組Th17細胞百分比;B:不同分期的結(jié)腸癌患者的Th17細胞百分比;C:結(jié)腸癌患者和健康對照組Th22細胞百分比;D:不同分期的結(jié)直腸癌患者的Th22細胞百分比Fig 1 Peripheral CD4+T cell Th17 and Th22 cell subsets in colon cancer patients A:percentage of Th17 cells in colon cancer patients and healthy controls;B:percentage of Th17 cells in patients with different stages of colon cancer;C:percentage of Th22 cells in colon cancer patients and healthy controls;D:percentage of Th22 cells in patients with different stages of colon cancer

2.2 結(jié)腸癌患者血清IL-17A和IL-22含量 如圖2所示，結(jié)腸癌患者血清IL-17A含量 (13.85±5.14)pg/ml高于健康對照 ［(4.10 ±2.22)pg/ml，P ＜0.0001］。隨著臨床進展，晚期結(jié)腸癌患者血清IL-17A含量與早期患者相比無明顯變化［StageⅢ-Ⅳ:(13.74±4.97)pg/ml;StageⅠ～Ⅱ:(13.98 ±5.46)pg/ml］;結(jié)腸癌患者血清 IL-22含量(37.75±10.29)pg/ml高于健康對照［(25.53 ±9.86)pg/ml，P ＜0.0001］。晚期結(jié)腸癌患者血清IL-22水平升高［StageⅢ～Ⅳ:(40.41±9.09)pg/ml;StageⅠ～Ⅱ:(34.28 ±10.91)pg/ml，P=0.0301］。

圖2 結(jié)腸癌患者血清IL-17A和IL-22含量 A:結(jié)腸癌患者和健康對照組血清IL-17A含量;B:不同分期的結(jié)腸癌患者血清IL-17A含量;C:結(jié)腸癌患者和健康對照組血清IL-22含量;D:不同分期的結(jié)直腸癌患者血清IL-22含量Fig 2 Serum IL-17A and IL-22 levels in patients with colon cancer A:serum IL-17A level in colon cancer patients and healthy controls;B:serum IL-17A level in patients with different stages of colon cancer;C:serum IL-22 level in colon cancer patients and healthy controls;D:serum IL-22 level in patients with different stages of colon cancer

2.3 體外IL-17A和IL-22對結(jié)腸癌細胞的作用 如圖3所示，IL-17A和IL-22促進結(jié)腸癌細胞HT-29增殖，抑制癌細胞凋亡。與對照組相比，IL-22處理后，HT-29細胞的增殖率升高和凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);IL-17A處理的HT-29細胞增殖率和凋亡率與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖3 IL-17A和IL-22對結(jié)腸癌HT-29細胞的作用 A:流式細胞術(shù)檢測IL-17A和IL-22作用后結(jié)腸癌細胞增殖;B:流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡實驗結(jié)果Fig 3 Effects of IL-17A and IL-22 on colon cancer HT-29 cells A:the proliferation of colon cancer cells after the action of IL-17A and IL-22 detected by flow cytometry;B:experimental results of apoptosis detected by flow cytometry

3 討論

本研究首先檢測了結(jié)腸癌患者外周血Th17、Th22細胞和血清細胞因子IL-17A和IL-22的變化，結(jié)果表明，結(jié)腸癌患者早期循環(huán)Th17細胞增加。隨著疾病進展，雖然晚期結(jié)腸癌 (StageⅢ～Ⅳ)患者的Th17細胞含量高于早期患者 (StageⅠ～Ⅱ)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。晚期結(jié)腸癌患者血清IL-17A含量與早期患者相比也無明顯變化。Th17細胞是一群異質(zhì)性細胞，能產(chǎn)生大量的IL-17A和其他細胞因子如IL-17F等，這些細胞因子可通過IL-17受體A(IL-17RA)觸發(fā)MAPK和 NF-κB信號通路，刺激產(chǎn)生促炎癥細胞因子、趨化因子和前列腺素［7-8］。Th17細胞的功能具有可塑性［9］，已有證據(jù)［10］表明，Th17 細胞參與腫瘤發(fā)生，但Th17及其細胞因子對于惡性腫瘤細胞的存活和生長有正反兩方面的作用。目前對于產(chǎn)生這種雙重作用的原因尚不明確。本文的臨床檢測和體外細胞實驗結(jié)果印證了前人的報道。

CD4+Th22細胞是一個T輔助細胞亞群。與Th1、Th2、Th17細胞不同，Th22細胞僅產(chǎn)生 IL-22。但IL-22還可由Th1和Th17細胞產(chǎn)生。Jiang等［11］研究表明，高水平的IL-22促進免疫缺陷小鼠體內(nèi)人大腸癌細胞 (HCT-116)的生長，這種作用與STAT3活化和STAT3下游效應(yīng)分子如cyclin D1上調(diào)有關(guān)。其他的報道［12-13］也證明，Th22細胞參與消化道惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與健康對照組相比，結(jié)腸癌患者的CD4+T細胞中Th22細胞顯著增加;晚期結(jié)腸癌患者的Th22細胞含量高于早期患者。同時結(jié)腸癌患者血清IL-22含量也呈一致的變化趨勢。

我們隨后檢測了體外IL-17A和IL-22對結(jié)腸癌HT-29細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，IL-22處理后，HT-29細胞的增殖率升高，凋亡率降低;IL-17A處理的HT-29細胞無論是增殖還是細胞凋亡，與對照組相比，均無顯著改變。IL-17A和IL-22聯(lián)合作用后，與對照組相比HT-29細胞的增殖顯著增加，但與單用IL-17A或IL-22處理組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;IL-17A和IL-22聯(lián)合作用后，HT-29細胞凋亡率與其他組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。分析結(jié)果產(chǎn)生的原因可能與實驗采用的細胞因子濃度和選擇的腫瘤細胞系及其他實驗條件的設(shè)定有關(guān)。進一步的研究需要通過體內(nèi)外實驗比較不同濃度和組合的細胞因子對結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的影響，并深入分析背后的作用機制。

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(責任編輯:王全楚)

The distribution of peripheral Th17 and Th22 cells and the roles of IL-17A and IL-22 in colon cancer patients

LI Shubin，SU Dongmei
Department of Internal Medicine，Guang’anmen Hospital(South Region)，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 102618，China

ObjectiveTo determine the distribution of peripheral Th17 and Th22 cells and the roles of IL-17A and IL-22 in colon cancer patients.MethodsFlow cytometry was used to determine the percentages of Th22 cells and Th17 cells in the peripheral blood of colon cancer patients.ELISA assay was adopted to examine the serum levels of IL-17A and IL-22.The effects of IL-17A and IL-22 on the proliferation and apoptosis of colon cancer cell line were detected by flow cytometry.ResultsThe percentages of peripheral Th17 and Th22 cells in colon cancer patients were significantly increased compared with controls.The level of IL-22 in serum was significantly increased in colon cancer patients compared with controls.IL-17A and IL-22 promoted cell proliferation and inhibited apoptosis in colon cancer cells.ConclusionThere are high percentages of Th22 and Th17 cells in colon cancer patients.Th22 and Th17 cells may jointly participate in the pathogenesis and progression of colon cancer.

Colon cancer;Th22 cells;Interleukin-22;Th17 cells;Interleukin-17A

R735.3

A

1006-5709(2017)08-0882-04

2016-12-27

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.011

李樹斌，主任醫(yī)師，研究方向:消化內(nèi)科及消化系腫瘤臨床研究。E-mail:lishb69@126.com

蘇冬梅，主治醫(yī)師，研究方向:中醫(yī)藥防治脾胃病及消化系腫瘤。E-mail:sdm1983@163.com