溫國華，李燕玲，陳倩雅

廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院1.腫瘤科;2.普外科，廣東廣州511300

環(huán)氧合酶-2蛋白和核因子κB在結(jié)腸癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究

溫國華1，李燕玲2，陳倩雅2

廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院1.腫瘤科;2.普外科，廣東廣州511300

目的 探討結(jié)腸癌中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)表達(dá)及其相關(guān)性。方法 選取廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院結(jié)腸癌患者48例作為結(jié)腸癌組，同時(shí)納入健康志愿者30名作為對(duì)照組。采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCR的方法對(duì)COX-2蛋白和NF-κB的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，分析其表達(dá)量與結(jié)腸癌之間的關(guān)系。結(jié)果 結(jié)腸癌組COX-2蛋白和NF-κB mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);COX-2蛋白和NF-κB在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2蛋白與NF-κB呈正相關(guān)。結(jié)論 結(jié)腸癌COX-2蛋白與NF-κB表達(dá)具有相關(guān)性，COX-2蛋白和NF-κB相對(duì)表達(dá)量可作為結(jié)腸癌是否轉(zhuǎn)移的預(yù)判指標(biāo)之一。

環(huán)氧合酶-2蛋白;核因子κB;相對(duì)表達(dá)量;結(jié)腸癌

近年來，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷上升，而且有年輕化的趨勢(shì)，腫瘤呈現(xiàn)局部侵襲性，且極易發(fā)生轉(zhuǎn)移。近二十年來，隨著新輔助化療和綜合治療的臨床應(yīng)用，結(jié)腸癌的療效已經(jīng)顯著提高，但仍有30%以上的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是其死亡的主要原因，因此，研究結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移對(duì)于改善結(jié)腸癌的預(yù)后具有重要的臨床意義［1］。核因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，已有大量研究證明，NF-κB參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展、分化和凋亡相關(guān)的功能性基因及細(xì)胞因子基因的表達(dá)［2］。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白是膜結(jié)合蛋白，在免疫細(xì)胞中，可以特異性地與細(xì)胞因子MIF結(jié)合，在血管內(nèi)外激活物激活的條件下可表達(dá)，在組織損傷及炎癥時(shí)表達(dá)增加，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著一定的關(guān)系［3］。因此，本課題擬用分子生物學(xué)和免疫組織學(xué)技術(shù)，分析COX-2蛋白和NF-κB在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)情況，探討其與結(jié)腸癌表達(dá)的關(guān)系，總結(jié)COX-2蛋白和NF-κB是否可作為結(jié)腸癌早期診斷、術(shù)前輔助診斷和病情監(jiān)測(cè)標(biāo)記物，研究COX-2蛋白和NF-κB與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)性，為結(jié)腸癌的早期診治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月-2015年1月廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院普外科行結(jié)腸癌手術(shù)的患者48例作為結(jié)腸癌組，同時(shí)納入健康志愿者30名作為對(duì)照組。對(duì)結(jié)腸癌組患者進(jìn)行隨訪觀察，平均隨訪時(shí)間為12個(gè)月。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。所有患者簽訂知情同意書，該臨床試驗(yàn)通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組患者年齡及性別比例比較Tab 1 Comparison between age and sex ratio between two groups

1.2 RNA提取及RT-PCR反應(yīng) 對(duì)結(jié)腸癌組患者行RNA提取，采用RNA提取試劑盒、TaqMan RNA試劑盒檢測(cè)COX-2蛋白和NF-κB的相對(duì)表達(dá)量。采用RNU6作為內(nèi)參進(jìn)行校正。對(duì)COX-2蛋白和 NF-κB的表達(dá)水平采用二步法檢測(cè)，第一步通過莖環(huán)引物合成互補(bǔ)DNA，對(duì)10 ng RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)采用的是RNA的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，加入10 μl的逆轉(zhuǎn)錄緩沖液至PCR管，將總RNA濃度調(diào)整至2 ng/μl，在以上基礎(chǔ)上加入5 μl的逆轉(zhuǎn)錄引物，并將反應(yīng)體系冰上反應(yīng)5 min，接著行梯度變性反應(yīng)，時(shí)間溫度遞減;第二步Platinum SYBR Green qPCR反應(yīng)體系，Taqman RNA的特異性引物與2×PCR Taqman Universal的混合液，通過逆轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反應(yīng)，首先將5 μl cDNA加入RNA中，擴(kuò)增至20 μl，遞減的擴(kuò)張40個(gè)循環(huán):94℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72℃、7 min之后，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，按照PCR操作說明，采用熒光實(shí)時(shí)定量反應(yīng)。應(yīng)用計(jì)算公式計(jì)算:△Ct=CtCOX-2蛋白和NF-κB-CtRNU6計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組間COX-2蛋白和NF-κB的相對(duì)表達(dá)量 結(jié)腸癌組COX-2蛋白和NF-κB mRNA表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見表2)。

表2 兩組間COX-2蛋白和NF-κB的相對(duì)表達(dá)量(±s)Tab 2 The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB between two groups(±s)

表2 兩組間COX-2蛋白和NF-κB的相對(duì)表達(dá)量(±s)Tab 2 The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB between two groups(±s)

分組 COX-2蛋白 NF-κB 0.82±0.31 0.72±0.26結(jié)腸癌組 1.12±0.56 1.10±0.29 t值 3.023 3.對(duì)照組0.026 0.021 652 P值

2.2 COX-2蛋白和NF-κB表達(dá)與結(jié)腸癌臨床參數(shù)之間的關(guān)系 COX-2蛋白和NF-κB在結(jié)腸癌有無轉(zhuǎn)移方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);但二者不同年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表3)。

表3 COX-2蛋白和NF-κB表達(dá)與結(jié)腸癌臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab 3 The relationship of the expressions of COX-2 protein and NF-κB with clinical parameters of colon cancer

2.3 COX-2蛋白和NF-κB之間的相關(guān)性 將COX-2蛋白水平分為升高、正常，對(duì)NF-κB水平進(jìn)行檢測(cè)，COX-2蛋白正常者，NF-κB 水平為(0.69 ±0.17)pg/ml，COX-2蛋白升高者，NF-κB 水平為(1.73 ±0.34)pg/ml，COX-2蛋白升高，NF-κB水平也隨之升高，COX-2蛋白與 NF-κB 呈正相關(guān)(r=0.626，P=0.001)。

3 討論

結(jié)腸癌位于全世界癌癥發(fā)病率排行的第三位，也是我國常見的消化道惡性腫瘤之一。多年來該病的發(fā)病率保持逐年上升的趨勢(shì)。其中該病的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后及治療效果的關(guān)鍵因素［4-6］。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)模式與分子遺傳學(xué)特性逐步被發(fā)現(xiàn)和了解。雖然廣大醫(yī)學(xué)和科研工作者進(jìn)行了充分且細(xì)致的研究，但是目前對(duì)于結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，仍缺乏有效且可靠的方法檢測(cè)及預(yù)測(cè)疾病的轉(zhuǎn)歸［7-9］。對(duì)于結(jié)腸癌相關(guān)的基因表達(dá)的研究，不僅對(duì)臨床上結(jié)腸癌的分子生物學(xué)分型、早期診斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)，還可以闡明結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的機(jī)制，且對(duì)治療評(píng)估有著重要的意義［10］，而對(duì)于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)并闡明其分子表面標(biāo)志物的表達(dá)模式，對(duì)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的靶向分子治療也具有重要的應(yīng)用價(jià)值［11］。因此，尋找生物學(xué)靶標(biāo)對(duì)于疾病的診治至關(guān)重要。本研究為探求該病的侵襲機(jī)制，尋找靶點(diǎn)基因與疾病的相關(guān)性，對(duì)該病的治療和預(yù)后判斷提供一定的指導(dǎo)價(jià)值。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究中被發(fā)現(xiàn)［12］。NF-κB可以在細(xì)胞受到外界信號(hào)刺激下激活，不同的刺激信號(hào)可通過不同的上游途徑誘導(dǎo)并直接入核，激活相應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄。作為一種多向性核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其DNA結(jié)合域可識(shí)別的DNA序列堿基數(shù)較短，因此可以激活多個(gè)靶基因的表達(dá)。已有大量研究證明，NF-κB參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、分化及凋亡相關(guān)的細(xì)胞因子、功能性基因的表達(dá)。NF-κB在肺癌、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中均存在異常表達(dá)。對(duì)該基因下游的信號(hào)通路也產(chǎn)生一定的影響，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移也發(fā)揮著重要的作用。NF-κB在結(jié)腸癌中的表達(dá)已有文獻(xiàn)報(bào)道。然而其在結(jié)腸癌細(xì)胞中起到的作用尚未完全闡明［13］。

COX-2蛋白是一類分子表面標(biāo)志物。已有研究［13］證明，COX-2蛋白在乳癌、肝癌及白血病細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)。在免疫細(xì)胞中，可以特異性地與細(xì)胞因子MIF結(jié)合，激活胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化。既往有研究證實(shí)，COX-2蛋白共刺激信號(hào)可能與NF-κB存在循環(huán)正反饋的雙向調(diào)控機(jī)制;COX-2蛋白與NF-κB的表達(dá)存在一定的相關(guān)性。COX-2蛋白還可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成間接刺激腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［14］。因此，COX-2蛋白對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多方面、多層次影響的，其主要通過自身分泌、相關(guān)受體、胞內(nèi)相關(guān)因子等環(huán)節(jié)影響腫瘤細(xì)胞的遷移和黏附及凋亡和分化能力，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。但是其具體調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)尚不明確。研究［15］發(fā)現(xiàn)，COX-2蛋白在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。而NF-κB和COX-2蛋白之間是否存在相互作用可以有助于更好地了解結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程，因此，本研究探討兩者相互作用及相關(guān)性，希望能進(jìn)一步了解結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制。

通常細(xì)胞發(fā)生病變轉(zhuǎn)化會(huì)造成相關(guān)基因的表型及其相關(guān)分子的相應(yīng)變化，這些變化可能成為細(xì)胞程序性惡化的誘因，且與正常細(xì)胞的生長特征不同，因此可為我們尋找新的結(jié)腸癌作用靶點(diǎn)及標(biāo)志物提供一定線索。在對(duì)COX-2蛋白和NF-κB的研究基礎(chǔ)上，我們通過深入探討COX-2蛋白和NF-κB作為診斷(早期診斷)、病情監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記物的可能性;研究COX-2蛋白和NF-κB共表達(dá)的狀況和消長關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩指標(biāo)之間具有互補(bǔ)應(yīng)用的可能性。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組COX-2蛋白和NF-κB mRNA的表達(dá)值均顯著高于健康志愿者;COX-2蛋白和NF-κB在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移方面差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;COX-2蛋白與NF-κB呈正相關(guān)。研究結(jié)果為結(jié)腸癌的早期防治提供新的思路和藥物作用靶標(biāo)，但更深入的分子機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

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(責(zé)任編輯:王全楚)

Expressions of cyclooxygenase-2 protein and nuclear factor-kappa B in colon cancer and their correlation

WEN Guohua1，LI Yanling2，CHEN Qianya2
1.Department of Oncology;2.Department of General Surgery，Zengcheng District People’s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 511300，China

ObjectiveTo investigate the expressions of cyclooxygenase-2(COX-2)protein and nuclear factor-kappa B(NF-κB)in colon cancer and their correlation.MethodsForty-eight cases of colon cancer patients were included in Zengcheng District People’s Hospital，at the same time，30 healthy volunteers were selected as control group.The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RTPCR).And the relationship between colorectal cancer and their expressions was also summarized.ResultsThe relative expressions of COX-2 protein and NF-κB in colorectal carcinoma group were significantly higher than those in control group(P ＜0.05).The differences of COX-2 protein and NF-κB in the metastasis of colon cancer were statistically significant(P ＜0.05).NF-κB was positively correlated with COX-2.ConclusionThe expression of COX-2 protein in colorectal cancer is correlated with the expression of NF-κB.The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB can be used as one of the predictive criteria for the metastasis of colon cancer.

Cyclooxygenase-2 protein;Nuclear factor-κB;Relative expression;Colon cancer

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0879-03

2017-03-27

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.010

溫國華，本科，住院醫(yī)師，研究方向:腫瘤相關(guān)治療。E-mail:wenguoh1229@163.com