龐曉輝，王朝杰，崔勇霞，高天慧

河南省人民醫(yī)院鄭州大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州450000

重樓皂苷I對(duì)結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株的毒性研究

龐曉輝，王朝杰，崔勇霞，高天慧

河南省人民醫(yī)院鄭州大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州450000

目的 探討重樓皂苷Ⅰ對(duì)結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞的體外毒性及其機(jī)制。方法 復(fù)蘇結(jié)腸癌SW480、LoVo細(xì)胞，采用大劑量沖擊法誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其耐藥性，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其侵襲性以鑒定其惡性生物學(xué)行為。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)耐藥細(xì)胞及其親代細(xì)胞的毒性作用，Annexin V/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞后Annexin V/PI陽(yáng)性細(xì)胞比例以檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。提取細(xì)胞總蛋白，Western blotting檢測(cè)重樓皂苷I處理細(xì)胞后細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspass-3等蛋白的表達(dá)。結(jié)果 大劑量奧沙利鉑沖擊法成功誘導(dǎo)奧沙利鉑耐藥細(xì)胞LoVo/L-OHP、SW480/LOHP。CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，LoVo/L-OHP、SW480/L-OHP的IC50值比其親代細(xì)胞提高5～25倍，Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，耐藥細(xì)胞比親代細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性(P＜0.019)。CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，重樓皂苷I對(duì)SW480、LoVo及其耐奧沙利鉑細(xì)胞的IC50值相似。Annexin V/PI染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例顯示，重樓皂苷I處理細(xì)胞后，Annexin V/PI陽(yáng)性細(xì)胞率明顯升高，Western blotting結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞后細(xì)胞中Bax和Caspass-3蛋白表達(dá)水平升高。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重樓皂苷Ⅰ能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞凋亡。結(jié)論 重樓皂苷I對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞及耐奧沙利鉑細(xì)胞均有良好的抗腫瘤活性，其抗腫瘤作用是通過(guò)介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

結(jié)腸癌;重樓皂苷I;奧沙利鉑

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)在全世界乃至中國(guó)都是發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，占胃腸道惡性腫瘤的第1位［1］，大部分患者需要化療，F(xiàn)OLFOX和FOLFIRI系列方案被證實(shí)對(duì)結(jié)直腸癌的一線治療方案。研究［2］證實(shí)這些化療方案對(duì)晚期結(jié)腸癌患者一線治療有效率均在50%左右。而二線化療的有效率僅有10%左右甚至更低。因而尋找能夠克服結(jié)腸癌耐藥的化療藥物具有重要的臨床意義和科研價(jià)值。

植物類抗腫瘤藥物是抗腫瘤藥物研發(fā)方向之一，重樓又名七葉一枝花，為延齡草科重樓屬植物華重樓滇重樓的干燥根莖［3-4］。藥理實(shí)驗(yàn)表明，重樓具有抗調(diào)節(jié)免疫、抑菌及鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜等多種生理活性［5-6］。重樓皂苷抗腫瘤的作用機(jī)理在于其能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞變性壞死［7］和凋亡［8-9］，也有研究［10］認(rèn)為其能夠通過(guò)抑制細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)的生物合成來(lái)達(dá)到抗腫瘤的作用?；蚪M學(xué)研究［11-12］顯示，重樓皂苷介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是通過(guò)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)實(shí)現(xiàn)的。

總之，耐藥性是結(jié)腸癌臨床治療中經(jīng)常遇到的問題［13］，而重樓皂苷具有良好的抗腫瘤作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及本課題組之前的研究結(jié)果［14］，本研究組建立研究假設(shè):重樓皂苷Ⅰ能夠克服耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞株耐受性。為了證實(shí)研究假設(shè)，本研究將采用大劑量沖擊法誘導(dǎo)耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞株，檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞的作用濃度，采用流式細(xì)胞術(shù)和Westernb blotting檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 重樓皂苷Ⅰ購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司，經(jīng)HPLC鑒定，純度均為97%。人結(jié)腸癌SW480、LoVo細(xì)胞由河南省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室所保存。SW480、LoVo細(xì)胞耐藥細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室所誘導(dǎo)。Hyclone澳大利亞新生胎牛血清購(gòu)自鄭州四季生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640、DMEM干粉培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司;胰蛋白酶、二甲基亞砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;CCK-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。Hanging Cell Culture Inserts、Matrigel膠均購(gòu)自BD Biosciences公司，奧沙利鉑購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司，AnnexinV-PI試劑購(gòu)自Takara公司。實(shí)驗(yàn)所用酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-rad公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自貝克曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng):將凍存管取出，立即放入38～40℃溫水中不斷搖晃，使冰凍的細(xì)胞液在30 s內(nèi)解凍，移入無(wú)菌離心管，SW480、LoVo細(xì)胞中分別加入含100 g/L胎牛血清的DMEM和1640高糖培養(yǎng)液10 ml輕輕吹打成懸液，1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入含100 g/L胎牛血清1640或DMEM高糖培養(yǎng)液4 ml，輕輕吹打成懸液，種入75 ml培養(yǎng)瓶，置于37℃含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)，次日可見細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，換液。3～5 d長(zhǎng)滿瓶底80%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。傳代后每2～3 d換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2 SW480、LoVo、Colo320耐奧沙利鉑細(xì)胞株的耐藥誘導(dǎo)與維持:上述細(xì)胞傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)至70%瓶底密度，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑IC50值、藥代動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞加藥處理后的反應(yīng)，確定加3 mg/L奧沙利鉑處理細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加藥處理約48 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至80%瓶底密度時(shí)進(jìn)行上述的細(xì)胞傳代，培養(yǎng)至80%細(xì)胞密度時(shí)繼續(xù)按前濃度加藥處理，一共加藥6次。實(shí)驗(yàn)組加藥結(jié)束脫藥1個(gè)月后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組細(xì)胞同步進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組、奧沙利鉑組及重樓組。實(shí)驗(yàn)時(shí)，96孔板每孔取5×103的細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24 h，待其貼壁進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后更換培養(yǎng)基，奧沙利鉑組加入含奧沙利鉑的培養(yǎng)基，使其終濃度達(dá)到 0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;重樓組分別加含重樓提取物Ⅰ的培養(yǎng)基，使其終濃度達(dá)到0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;陰性對(duì)照組加入與實(shí)驗(yàn)組相同濃度的DMSO。以上細(xì)胞加藥培養(yǎng)48 h后換100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基并加入10 μl CCK-8，孵箱孵育2 h后放入酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)450 nm處的吸光值，630 mm吸光值作為參照。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):用含100 g/L胎牛血清的DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好的情況下?lián)Q無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集培養(yǎng)上清液，過(guò)濾除菌，冰凍保存?zhèn)溆?Matrigel膠與無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液按1∶2.5比例稀釋凝膠，冰浴稀釋液并逐一包被Transwell小室底部，將小室放入24孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱，待膠凝后即可用;在小室外加入1 ml按1∶1混合的條件培養(yǎng)液和完全培養(yǎng)液，在小室內(nèi)加入400 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為1×104，培養(yǎng)液為含10 g/L BSA和10 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。每組重復(fù)4個(gè)樣本;細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)48 h;取出Transwell小室，PBS清洗，用棉簽輕輕擦去微孔膜上層的細(xì)胞，950 ml/L酒精固定，蘇木素染色。細(xì)胞數(shù)量不多時(shí)計(jì)數(shù)全視野穿膜的細(xì)胞，數(shù)量多時(shí)隨機(jī)挑取10個(gè)視野計(jì)數(shù)。相對(duì)侵襲指數(shù)(relative invasion index)的計(jì)算公式:N2/N1×100%，其中N2代表耐藥細(xì)胞的穿膜數(shù)，N1代表對(duì)照細(xì)胞的穿膜數(shù)。

1.2.5 Western blotting實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，1×106細(xì)胞/75 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)24 h，待其貼壁生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，實(shí)驗(yàn)組加0.8 mg/L的重樓皂苷Ⅰ，對(duì)照組加入相同濃度的DMSO。37℃培養(yǎng)24 h、48 h后，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用50～100 μl三去污裂解液重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打3～5 min?；靹蚝笥?℃溫育20 min，12 000×g離心20 min后取上清檢測(cè)細(xì)胞總蛋白，紫外分光光度法檢測(cè)蛋白含量，按比例加入加樣緩沖液。取蛋白樣品12 μg，進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入10 g/L脫脂奶粉稀釋的抗 Bax、Caspass-3、β-actin 的抗體(1∶1 000)4℃過(guò)夜，PBS洗滌3次，加入二抗(1∶2 000)，室溫輕搖2 h，最后用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)顯色。

1.2.6 Annexin V/PI染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV/PI陽(yáng)性細(xì)胞比例:本實(shí)驗(yàn)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)時(shí)，取6孔板，每孔加入5×105的細(xì)胞培養(yǎng)24 h，待其貼壁并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，實(shí)驗(yàn)組加1 mg/L的重樓皂苷Ⅰ，對(duì)照組加相同濃度的DMSO。在37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞:懸浮細(xì)胞直接收集到離心管中，而貼壁細(xì)胞消化使之脫壁，500～1 000 r/min離心5 min棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗1次，500～1 000 r/min離心5 min。再用孵育緩沖液洗1次，500～1 000 r/min離心5 min，用100 μl的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。500～1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，孵育緩沖液洗1次。加入熒光溶液4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑誘導(dǎo)出對(duì)奧沙利鉑耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞為了研究重樓皂苷Ⅰ對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞及結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞的毒性作用，我們根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)，誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)所需的耐藥細(xì)胞。最終確定誘導(dǎo)的奧沙利鉑濃度為1 mg/L。選用LoVo、SW480細(xì)胞。初次加藥后24 h細(xì)胞死亡率達(dá)80%，待細(xì)胞長(zhǎng)至約70%平底面積時(shí)傳代培養(yǎng)，如此反復(fù)加藥處理8次，最后一次加藥后培養(yǎng)24 h細(xì)胞死亡率為20%。脫藥培養(yǎng)1個(gè)月后檢測(cè)細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑耐藥性。LoVo細(xì)胞和SW480細(xì)胞的IC50值分別為2.713 mg/L和4.987 mg/L。耐藥性分別提高了24倍和7倍(見表1)。

表1 重樓皂苷Ⅰ及奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值(±s，mg/L)Tab 1 PolyphyllinⅠand oxaliplatin on colon cancer cells IC50(±s，mg/L)

表1 重樓皂苷Ⅰ及奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值(±s，mg/L)Tab 1 PolyphyllinⅠand oxaliplatin on colon cancer cells IC50(±s，mg/L)

組別 重樓皂苷Ⅰ 奧沙利鉑LoVo 0.419±0.028 0.113±0.021 LoVo/L-OHP 0.801±0.107 2.713±0.110 SW480 0.404±0.113 0.670±0.051 SW480/L-OHP 1.095±0.205 4.987±0.127

2.2 耐藥細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性 我們采用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其侵襲性。結(jié)果顯示，SW480/L-OHP穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于SW480細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.019，見圖1)。相對(duì)侵襲指數(shù)為1.84。奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株比親代細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性，具有較強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為(見圖1)。

2.3 重樓皂苷Ⅰ對(duì)耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性 CCK-8檢測(cè)重樓皂苷Ⅰ對(duì)SW480細(xì)胞及其奧沙利鉑耐藥細(xì)胞的毒性。采用梯度濃度的重樓皂苷Ⅰ處理細(xì)胞48 h，CCK-8檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ對(duì)SW480細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞的IC50值相近。重樓皂苷Ⅰ對(duì)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞具有相同的抗腫腫瘤活性(見表1)。

圖1 耐藥細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性 A:LoVo;B:LoVo/L-OHPFig 1 Resistant cells were more aggressive A:LoVo;B:Lo-Vo/L-OHP

2.4 流式細(xì)胞術(shù)及Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)重樓皂苷Ⅰ對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的毒性是通過(guò)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn) 與對(duì)照組相比，加藥培養(yǎng)的細(xì)胞中AnnexinV/PI雙染色及AnnexinV染色陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增加。重樓皂苷Ⅰ能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(見圖2)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重樓皂苷Ⅰ能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:加藥處理的細(xì)胞Bax、Caspass-3蛋白表達(dá)升高。重樓皂苷Ⅰ能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤特性(見圖3)。

圖2 重樓皂苷Ⅰ誘導(dǎo)LoVo及其耐藥細(xì)胞凋亡 A:LoVo;B:重樓皂苷Ⅰ處理后的LoVo;C:LoVo/L-OHP;D:重樓皂苷Ⅰ處理后的LoVo/L-OHPFig 2 LoVo induced by Polyphyllin I and its resistance to apoptosis A:LoVo;B:LoVo after treatment of Polyphyllins I;C:LoVo/L-OHP;D:LoVo/L-OHP after treatment of PolyphyllinsⅠ

圖3 重樓皂苷Ⅰ能促進(jìn)LoVo及其耐藥細(xì)胞Caspass-3和Bax蛋白不表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡Fig 3 Polyphyllins I could promote expressions of Caspass-3 and Bax protein in LoVo cell and resistant cells，promote cell apoptosis

3 討論

臨床上，結(jié)直腸癌化療行之有效的藥物為氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等藥物。研究顯示，一線化療對(duì)50%以上的結(jié)直腸癌患者有效，二線化療的有效率則不到10%。因此，尋找對(duì)耐藥患者有效的藥物有著重要的臨床意義和科研價(jià)值。

重樓皂苷Ⅰ為重樓的提取物，具有良好的抗腫瘤作用，能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)肝癌、肝癌、卵巢癌等細(xì)胞株均具有良好的抗腫瘤作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ對(duì)4個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞株均具有良好的抗腫瘤作用。本研究為了深入研究其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用及其對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的作用，采用大劑量沖擊法誘導(dǎo)結(jié)腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞，CCK-8研究其對(duì)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的作用濃度，流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting檢測(cè)其作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞具有相近的作用濃度，AnnexinV/PI染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞顯示，重樓皂苷Ⅰ處理后，AnnexinV/PI陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯升高。Western blotting顯示，重樓皂苷Ⅰ能夠上調(diào)Bax、Caspass3蛋白表達(dá)，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果具有重要的臨床意義，為逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥提供了一個(gè)新的研究方向，為重樓皂苷Ⅰ的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。然而本研究也有其局限性，例如:本研究未進(jìn)行深入的機(jī)制研究，不能具體闡釋重樓皂苷Ⅰ是否是通過(guò)蛋白、DNA、酶體等機(jī)制介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，缺乏相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究。本課題組將繼續(xù)本項(xiàng)研究，為結(jié)腸癌藥物的研發(fā)指出一個(gè)新的方向。

［1］IARC.GLOBOCAN 2012:cancer incidence，mortality and prevalence worldwide in 2012［EB/OL］.［2013-12-12］.http://globocan.iarc.fr/Default.aspx.

［2］Tournigand CT，Andre E，Achille G，et al.FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer:a randomized GERCOR study ［J］.J Clin Oncol，2004，22(2):229-237.

［3］Yang QX，Yang CR.Cytotoxic steroidal saponins from Polygonatum punctatum［J］.Chem Biodivers，2006，3(12):1349-1355.

［4］邊洪榮，李小娜，王會(huì)敏.重樓的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.中藥材，2002，25(3):218-220.

［5］劉銀花，王躍華，何新友，等.重樓愈傷組織的抑菌作用研究［J］.成都大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，34(1):12-15.

［6］陳清，閻姝.重樓的藥理作用及其毒性反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(7):886-888.

［7］Yan LL，Zhang YJ，Gao WY，et al.In vitro and in vivo anticancer activity of steroid saponins of Paris polyphylla var.Yunnanensis ［J］.Exp Oncol，2009，31(1):27-32.

［8］Cheung JY，Ong RC，Suen YK，et al.Polyphyllin D is a potent apoptosis inducer in drug-resistant HepG2 cells［J］.Cancer Lett，2005，217(2):203-211.

［9］Fernandez-Herrera MA，Lopez-Munoz H，Hernandez-Vazquez JM，et al.Synthesis of 26-hydroxy-22-oxocholestanic frameworks from diosgenin and hecogenin and their in vitro antiproliferative and apoptotic activity on human cervical cancer CaSki cells［J］.Bioorg Med Chem，2010，18(7):2474-84.

［10］石小楓，杜德極.重樓皂苷對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤細(xì)胞核酸和蛋白質(zhì)生物合成的影響［J］.中藥藥理與臨床，1988，4(4):30.

［11］Ong RC，Lei J，Lee RK，et al.Polyphyllin D induces mitochondrial fragmentation and acts directly on the mitochondria to induce apoptosis in drug-resistant HepG2 cells［J］.Cancer Lett，2008，261(2):158-64.

［12］Siu FM，Ma DL，Cheung YW，et al.Proteomic and transcriptomic study on the action of a cytotoxic saponin(Polyphyllin D):induction of endoplasmic reticulum stress and mitochondria-mediated apoptotic pathways［J］.Proteomics，2008，8(15):3105-3117.

［13］Nguyen VT，Darbour N，Bayet C，et al.Selective modulation of P-glycoprotein activity by steroidal saponines from Paris polyphylla［J］.Fitoterapia，2009，80(1):39-42.

［14］龐曉輝，王朝杰，史祖宣，等.四種重樓皂苷對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的體外毒性作用比較［J］.山東醫(yī)藥，2016，56(13):13-16.Pang XH，Wang ZJ，Shi ZX，et al.In vitro toxicity of four kinds of polyphyllins on colon cancer cells［J］.Shandong Medical Journal，2016，56(13):13-16.

(責(zé)任編輯:馬 軍)

Study on toxicity of PolyphyllinⅠon colon cancer cell lines resistant to oxaliplatin

PANG Xiaohui，WANG Chaojie，CUI Yongxia，GAO Tianhui
Department of Oncology，Henan Provincial People’s Hospital，People’s Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

ObjectiveTo investigate the anticancer activity of PolyphyllinⅠ on colon cancer cell lines resistant to oxaliplatin.MethodsPolyphyllinⅠwas isolated from the rhizome of Sichuan polyphylla.The oxaliplation resistant cells(SW480/L-OHP，LoVo/L-OHP)were established by continuously exposing to high-dose concentration of oxaliplatin(L-OHP).The oxaliplation resistant cells and their parental cells were cultured and then treated with stepwise concentrations(0.1，0.5，1，2，4，8 mg/L)of Polyphyllin I for 48 hours，respectively.The inhibiting rates of SW480，LoVo cells by Polyphyllin I were determined by CCK-8 assay.Transwell migration assays was used to assess cell invasion viability.Cells were stained with Annexin V/PI in the detection of apoptosis by flow cytometry.Total protein was extracted and Western blotting was used to detect the expressions of Bax and Caspass-3 after cultured with Polyphyllin I for 24 hours.ResultsLoVo-OHP，SW480/L-OHP were induced successfully by large dose of oxaliplatin method.CCK-8 cytotoxicity tests showed that IC50values of LoVo-OHP and SW480/L-OHP were increased by 5-25 times than those of their parental cells.The proportion of Annexin V/PI positive cells elevated after treated with PolyphyllinⅠ.PolyphyllinⅠup-regulated expressions of Bax and Caspass-3 PolyphylinesⅠcould promote the apoptosis of colon cancer and resistant cells.ConclusionPolyphyllin I shows anticancer activity against oxaliplatin resistant colon cancer cell in vitro.

Colon cancer;Polyphyllin I;Oxaliplatin

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0865-04

2017-06-05

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.007

龐曉輝，主治醫(yī)師，博士，研究方向:惡性腫瘤的臨床診治。E-mail:pangxh0321@163.com

高天慧，主任醫(yī)師，博士，研究方向:惡性腫瘤的臨床診治。E-mail:gaotianhui123456@163.com