曾利紅，林 欣，何 杰，黃惠康，杜艷蕾，趙 沖，魏 芳，王 紅

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510180

具核梭桿菌通過上調(diào)c-Jun表達(dá)促進結(jié)直腸癌細(xì)胞系caco-2的DNA復(fù)制

曾利紅，林 欣，何 杰，黃惠康，杜艷蕾，趙 沖，魏 芳，王 紅

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510180

目的 研究具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)促進結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)細(xì)胞系caco-2 DNA復(fù)制，并初步探討其機制。方法 Fn感染caco-2細(xì)胞后，通過EdU檢測caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制情況，采用RT-PCR及Western blotting檢測c-Jun基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，Western blotting檢測細(xì)胞增殖相關(guān)基因CCND1的表達(dá)，利用siRNA敲低c-Jun表達(dá)，Western blotting技術(shù)檢測感染Fn后caco-2細(xì)胞CCND1蛋白表達(dá)及EdU檢測caco-2 DNA復(fù)制情況。結(jié)果 Fn感染caco-2細(xì)胞6 h后，caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制顯著增加，c-Jun和Cyclin D1表達(dá)量增加，F(xiàn)n感染并敲低c-Jun后，caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制減少，Cyclin D1蛋白表達(dá)量也顯著降低。結(jié)論 Fn可通過上調(diào)c-Jun的表達(dá)促進CRC細(xì)胞系caco-2的DNA復(fù)制。

具核梭桿菌;結(jié)直腸癌;c-Jun;caco-2

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的消化道腫瘤，其發(fā)生是一個多階段、多步驟的病理過程，與多個癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)。近年來研究［1］發(fā)現(xiàn)，腸道菌群也可能通過腸道黏膜屏障受損、慢性炎癥反應(yīng)、細(xì)菌酶、毒性代謝產(chǎn)物作用等多種機制促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展。其中具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n)被認(rèn)為與CRC的發(fā)生、發(fā)展高度相關(guān)。Fn屬梭桿菌屬，是革蘭陰性無芽孢桿菌，專性厭氧，不具有運動能力。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n可通過代謝產(chǎn)物(丁酸、硫化氫)等破壞腸上皮DNA完整性，其中硫化氫可為CRC細(xì)胞的能量代謝來源，促進其增殖，F(xiàn)n還可通過結(jié)構(gòu)蛋白與宿主細(xì)胞相識別，啟動炎癥相關(guān)下游信號通路，促進IL-6、IL-8、IL-18的釋放。c-Jun基因是禽肉瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒基因ASV17的細(xì)胞內(nèi)同源基因。研究［2］顯示，c-Jun基因在蛋白水平或基因的改變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。c-Jun與激活的ras基因一起可以轉(zhuǎn)化細(xì)胞，c-Jun蛋白是細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)物［3］。目前尚無研究證實，F(xiàn)n感染CRC細(xì)胞后促進c-Jun基因的表達(dá)，并通過上調(diào)c-Jun基因的表達(dá)促進CRC細(xì)胞DNA復(fù)制。本研究擬針對Fn感染CRC細(xì)胞株系caco-2細(xì)胞，探討用共培養(yǎng)的方法讓Fn感染CRC細(xì)胞系caco-2細(xì)胞后上調(diào)c-Jun基因的表達(dá)對caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制是否有調(diào)節(jié)作用及該調(diào)節(jié)作用與哪些基因的激活與抑制相關(guān)，為Fn致癌機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料與儀器 RIPA裂解液、Cooktail、蛋白濃度測定試劑盒、Lipo3000等均購自美國Thermo Fisher Scientific公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠抗體等均購自美國ABCAM生物有限公司，兔抗人c-Jun多克隆抗體購自美國CST公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液均購自美國Millipore公司，針對c-Jun特異性小干擾RNA及陰性對照小干擾RNA、EdU試劑盒均購自銳博生物有限公司，opti-MEM、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶等均購自美國Life公司，胎牛血清、腦心浸液肉湯、哥倫比亞血平板培養(yǎng)基、caco-2細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(H90中國力康公司)、共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、NaNoDROP(美國Thermo Fisher Scientific公司)、BIO-RAD電泳儀(美國BIO-RAD公司)、化學(xué)發(fā)光分子成像系統(tǒng)(TANON公司)、熒光定量梯度PCR儀(qTower2.0德國耶拿公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng):Fn菌株ATCC10953(購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心)接種于哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，生化鑒定、傳代。液體培養(yǎng)20 h后4 000 r/min，Rt離心10 min，收集細(xì)菌，PBS洗滌3次，重懸于PBS溶液中，NaNoDROP測量600 nm的吸光度值，將菌懸液調(diào)制1×108CFU/ml備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):人結(jié)腸癌細(xì)胞株caco-2購自美國ATCC公司，經(jīng)復(fù)蘇后，用含200 g/L胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液進行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。將caco-2細(xì)胞鋪于細(xì)胞6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁融合度達(dá)到70%時，更換新鮮無雙抗培養(yǎng)基，加入Fn，分別共培養(yǎng)6 h、12 h，收集樣品檢測。實驗設(shè)對照組與感染組，未加細(xì)菌組為對照組(Blank)，加細(xì)菌處理組為感染組(Fn+)，MOI=1∶200。

1.2.3 轉(zhuǎn)染:siRNA轉(zhuǎn)染實驗參照LIPO 3000試劑說明書進行操作。轉(zhuǎn)染前1 d將1.5×105個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，一共設(shè)置3組，分為空白對照組(Blank)、陰性對照組(NC control)、sic-Jun 組。

1.2.4 EdU:將24 mm×24 mm蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，每孔約1×105個細(xì)胞，待細(xì)胞融合至70%時，更換新鮮培養(yǎng)基，按 MOI=200∶1加入 Fn共培養(yǎng)6 h，PBS清洗3次后，按EdU試劑盒說明書按步驟加入試劑，染色、固定、封片，避光保存，由廣州市第一人民醫(yī)院中心實驗室共聚焦顯微鏡室進行熒光拍攝。

1.2.5 RT-PCR檢測 Fn:感染 Caco-2細(xì)胞6 h、12 h后，分別以 Trizol提取總 RNA。Prime Script RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄cDNA，實時PCR擴增。各引物序列見表1。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Western blotting檢測 Fn:感染 Caco-2細(xì)胞6 h、12 h后，提取總蛋白，測定蛋白質(zhì)量濃度。取20 μl蛋白樣品進行 SDS-PAGE，80 V恒壓模式電泳20 min后轉(zhuǎn)110 V恒壓電泳，350 mA電流轉(zhuǎn)膜70 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗后4℃孵育過夜。TBST清洗3遍，與相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3遍，加入化學(xué)發(fā)光液室溫作用1 min，化學(xué)發(fā)光分子成像儀曝光。每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示。兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實時定量PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for real time PCR

2 結(jié)果

2.1 Fn感染促進caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制 Fn與caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)12 h(MOI=200)，建立Fn與caco-2的感染模型，EdU檢測DNA復(fù)制情況，與對照組相比，細(xì)胞復(fù)制顯著活躍(見圖1A、1B，P＜0.01)。Western blotting檢測G1/S期檢驗點關(guān)鍵蛋白Cyclin D1的表達(dá)情況，與對照組相比，感染6 h后，Cyclin D1表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1C、1E，P＞0.05)，感染12 h后，Cyclin D1表達(dá)量明顯升高(見圖1D、1E，P＞0.05)。

圖1 Fn感染caco-2促進DNA復(fù)制 A:聚焦內(nèi)鏡下Fn感染caco-2 DNA復(fù)制(400×);B:總細(xì)胞和EdU陽性細(xì)胞進行計數(shù)，統(tǒng)計陽性細(xì)胞所占比例(n=120);C:共培養(yǎng)6 h，Western blotting檢測Cyclin D1蛋白后灰度掃描統(tǒng)計;D:共培養(yǎng)12 h，Western blotting檢測CyclinD1蛋白后灰度掃描統(tǒng)計;E:Fn感染組與空白組Cyclin D1蛋白水平Fig 1 Fn stimulated the DNA-replikation of caco-2 cells A:DNA replication results in caco-2 cells after Fn infection by confocal microscopy(400 × );B:DNA replication results in caco-2 cells after Fn infection by EdU detection in bar chart，C:after co-culture 6 hours，CyclinD1 protein detected by Western blotting;D:after co-culture 12 hours，Cyclin D1 protein detected by Western blotting;E:expression of Cyclin D1 protein by Western blotting

2.2 Fn感染促進caco-2細(xì)胞c-Jun、炎癥因子IL-8表達(dá)上調(diào) Fn與caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)6 h(MOI=200)，進行RNA-sequencing檢測c-Jun、IL-8 mRNA表達(dá)，與對照組相比，c-Jun、IL-8 mRNA表達(dá)顯著增加(見圖2A，P ＜0.01;見圖2B，P＜0.001)。RT-PCR 進一步驗證c-Jun、炎癥因子 IL-8 mRNA表達(dá)情況，c-Jun、IL-8轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著上調(diào)(見圖2C～2F，P＜0.01)。Western blotting進一步驗證c-Jun蛋白水平表達(dá)，與對照組相比，c-Jun蛋白表達(dá)量顯著升高(見圖2G～2I，P＜0.05)。

圖2 Fn感染組與空白對照組c-Jun、IL-8 mRNA水平、蛋白水平表達(dá)量比較 A:RNA-requencing檢測c-Jun;B:RNA-requencing檢測IL-8;C:共培養(yǎng)6 h，RT-PCR檢測c-Jun mRNA水平;D:共培養(yǎng)12 h，RT-PCR檢測c-Jun mRNA水平;E:共培養(yǎng)6 h，RT-PCR檢測IL-8 mRNA水平;F:共培養(yǎng)12 h，RT-PCR檢測IL-8 mRNA水平;G:共培養(yǎng)6 h，Western blotting檢測c-Jun蛋白后灰度掃描統(tǒng)計;H:共培養(yǎng)12 h，Western blotting檢測c-Jun蛋白后灰度掃描統(tǒng)計;I:Western blotting檢測c-Jun蛋白表達(dá)Fig 2 Expressions of c-Jun and IL-8 in Fn group and blank group A:RNA-requencing of c-Jun;B:RNA-requencing of IL-8;C:the mRNA level of c-Jun after 6 hours co-culture by RT-PCR;D:the mRNA level of c-Jun after 12 hours co-culture by RT-PCR;E:the mRNA level of IL-8 after 6 hours co-culture by RT-PCR;F:the mRNA level of IL-8 after 12 hours co-culture by RT-PCR;G:the protein level of c-Jun after 6 hours co-culture by Gary-scan analysis;H:the protein level of c-Jun after 12 hours co-culture by Gary-scan analysis;I:the protein level of c-Jun by Western blotting

2.3 Fn通過上調(diào)c-Jun表達(dá)促進細(xì)胞DNA復(fù)制在caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染c-Jun siRNA 12 h后，加入Fn共培養(yǎng)12 h，EdU檢測DNA復(fù)制情況，與對照組相比，細(xì)胞復(fù)制顯著活躍(見圖3A、3B，P＜0.01)。Fn共培養(yǎng)12 h，Western blotting檢測Cyclin D1蛋白水平表達(dá)情況，與對照組相比，Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著下降(見圖3C、3D，P ＜0.01)。

圖3 c-Jun siRNA轉(zhuǎn)染后caco-2 DNA復(fù)制相關(guān)指標(biāo)結(jié)果 A:激光共聚焦顯微鏡觀察EdU檢測Fn感染sic-Jun轉(zhuǎn)染后caco-2 DNA復(fù)制(400×);B:對視野中總細(xì)胞和EdU陽性細(xì)胞進行計數(shù)，統(tǒng)計陽性細(xì)胞所占比例(n=120);C:對sic-Jun轉(zhuǎn)染caco-2細(xì)胞后Fn處理組與空白組Cyclin D1 Western blotting結(jié)果進行灰度掃面統(tǒng)計;D:Western blotting檢測sic-Jun轉(zhuǎn)染caco-2細(xì)胞后Fn處理組與空白對照組Cyclin D1Fig 3 Fn stimulated the DNA-replikation of caco-2 cells after transfection A:DNA replication results in caco-2 cells after c-Jun si-RNA infection by confocal microscopy(400×);B:DNA replication results in caco-2 cells after c-Jun siRNA infection by EdU detection in bar chart;C:Gray-scan analysis results of Cyclin D1 protein in caco-2 cells after c-Jun siRNA infection by Western blotting;D:expression of Cyclin D1 protein by Western bloting

3 討論

在CRC的發(fā)生、發(fā)展中，腫瘤微環(huán)境的作用是一個重要因素，腫瘤細(xì)胞周圍的間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞及各種細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子、免疫因子等構(gòu)成了腫瘤細(xì)胞相互作用的內(nèi)環(huán)境，成為腫瘤微環(huán)境(tumor enviroment，TME)。腫瘤微環(huán)境中，慢性炎癥是促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。炎性微環(huán)境中存在的活性氮和活性氧物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞的DNA發(fā)生基因突變，誘發(fā)了細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，炎性環(huán)境過度激活促增殖通路和抑制凋亡的通路，而持續(xù)的炎癥狀態(tài)又為細(xì)胞的惡性增殖、血管新生、癌細(xì)胞的遷移和侵襲提供了必要的環(huán)境，進一步加速了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進程［4］。在胃腸道癌癥的發(fā)生、發(fā)展中，慢性炎癥往往與微生物的感染有關(guān)。在多項研究中均發(fā)現(xiàn)腸道菌群紊亂與CRC有關(guān)，腸道菌群通過其結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)菌酶、毒性代謝產(chǎn)物促進腸黏膜局部慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展，同時，研究人員證實，小鼠腸道微生物組不僅影響了局部炎癥，還影響了全身炎癥的形成［5］。腸道菌群中，F(xiàn)n已被證實與炎癥性腸病、腸腺瘤、CRC等多種腸道疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6-7］。Fn可以通過脂蛋白Fad-I被宿主Toll樣受體-1/2(TLR-1/2)和Toll樣受體2/6(TLR-1/2)識別并上調(diào)防御素β2(β-defensin3)表達(dá)，而感染Fn的CRC細(xì)胞系，在裸鼠體內(nèi)比未感染的細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)更快形成腫瘤，體積也更大［8］。Fn感染結(jié)腸細(xì)胞后能直接激活 TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路［9］。

綜合已有的研究，F(xiàn)n侵襲宿主上皮后可促進炎癥和促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Fn侵襲入上皮細(xì)胞后促進炎癥相關(guān)因子 TNF-α、IL-8、IL-1β 等表達(dá)上調(diào)［4］。在我們的研究中也觀察到Fn感染caco-2細(xì)胞顯著上調(diào)IL-8轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。Fn的感染能促進細(xì)胞增殖［10］，在我們的研究中，通過Western blotting檢測Cyclin D1表達(dá)和EdU發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染caco-2細(xì)胞能夠顯著促進caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制，DNA復(fù)制積累，進一步增加了DNA復(fù)制錯誤發(fā)生率和染色體損傷。在細(xì)胞中，細(xì)胞每分裂一次，即DNA復(fù)制每發(fā)生一次，堿基錯配的概率為1/1010～1/109，DNA錯配發(fā)生率增加，也可能造成DNA錯配修復(fù)異常。Tomasetti等［12］利用其數(shù)學(xué)模型將來自英國的32種癌癥病例患者進行分析，發(fā)現(xiàn)66%的癌癥驅(qū)動基因突變源于DNA復(fù)制錯誤，癌癥的發(fā)生、發(fā)展與DNA復(fù)制錯誤有關(guān)。

Fn能通過其毒力因素如FadA、Fap2和梭菌屬外膜蛋白FomA識別、侵襲入血管內(nèi)皮和腸上皮細(xì)胞，激活多個信號通路，如 β-catenin［10］、NF-κB［10］等，但目前，較少有研究顯示Fn感染引發(fā)結(jié)腸炎癥和致癌作用的下游事件。c-Jun是禽肉瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒基因ASV17的細(xì)胞內(nèi)同源基因，c-Jun蛋白水平或基因的改變與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，c-Jun可能通過抑制WWOX的腫瘤抑制作用促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展［2］。在本研究中，F(xiàn)n感染能夠促進caco-2細(xì)胞高表達(dá)c-Jun蛋白和Cyclin D1，當(dāng)caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染c-jun特異性siRNA后，F(xiàn)n感染不能引起Cyclin D1高表達(dá)，因此，F(xiàn)n感染引起的Cyclin D1高表達(dá)與c-Jun高表達(dá)直接相關(guān)，而Cyclin D1是DNA復(fù)制的標(biāo)志性蛋白，也說明c-Jun高表達(dá)在促進DNA復(fù)制過程發(fā)揮著關(guān)鍵作用。c-Jun是β-catenin信號通路中的靶基因，能夠整合細(xì)胞內(nèi)外多種刺激調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。Fn可利用獨特的FadA與宿主細(xì)胞內(nèi)Ecadherin結(jié)合，抑制抑癌基因的抑制作用，激活β-catenin信號通路，上調(diào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子［11］。因此，F(xiàn)n感染引起的c-Jun蛋白高表達(dá)與促進DNA復(fù)制作用可能是通過β-catenin信號通路的激活來實現(xiàn)。目前，普遍認(rèn)為癌癥是癌癥驅(qū)動基因發(fā)生突變后造成細(xì)胞異常增殖引起，而引起癌癥驅(qū)動基因發(fā)生突變的原因主要有遺傳、環(huán)境和DNA復(fù)制錯誤等［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染能夠引起DNA復(fù)制相關(guān)蛋白Cyclin D1表達(dá)增加，促進DNA復(fù)制，F(xiàn)n感染能夠上調(diào)c-Jun表達(dá)，F(xiàn)n感染對DNA復(fù)制的調(diào)控可能是通過上調(diào)c-Jun表達(dá)介導(dǎo)的。

綜上所述，F(xiàn)n感染促進caco-2細(xì)胞c-Jun表達(dá)上調(diào)，促進caco-2細(xì)胞DNA復(fù)制，且Fn感染對DNA復(fù)制的促進作用與高表達(dá)c-Jun顯著相關(guān)，F(xiàn)n感染促進c-Jun的表達(dá)可能與β-catenin信號通路激活有關(guān)。但是c-Jun同時也是MAPK信號通路中的下游靶基因，本實驗中尚未檢測Fn感染caco-2細(xì)胞后β-catenin的表達(dá)情況，也并未進行β-catenin特異性si-RNA轉(zhuǎn)染實驗檢測c-Jun表達(dá)，以確定Fn感染后高表達(dá)c-Jun與β-catenin的直接聯(lián)系。

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(責(zé)任編輯:王全楚)

Up-regulated expression of c-Jun by Fusobacterium nucleatum to promote DNA replication in caco-2 cell line

ZENG Lihong，LIN Xin，HE Jie，HUANG Huikang，DU Yanlei，ZHAO Chong，WEI Fang，WANG Hong
Department of Gastroenterology，Guangzhou First People’s Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China

ObjectiveTo investigate the DNA-replication induced by Fusobacterium nucleatum(Fn)in human colorectal cancer(CRC)cell line caco-2 cells，in order to make a preliminary discussion on the mechanism.MethodsThe DNA-replication was detected by EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)and the expression of c-Jun was detected by RT-PCR and Western blotting after caco-2 cells infected with Fn.The expression of CCND1 was detected by Western blotting after caco-2 cells infected with Fn.c-Jun was knocked down by specific siRNA transfection cells，while these cells were infected by Fn，the DNA-replication was detected by EdU as wells as the expression of CCND1 was detected by Western blotting.ResultsAfter 6 hours infected by Fn，DNA-replication detected by EdU was significantly increased in caco-2 cells.The levels of c-Jun and Cyclin D1 were significantly increased in caco-2 cells during Fn infection.Furthermore，When Fn was infected and c-Jun was knocked down，the DNA-replication was decreased in caco-2 cells and the expression of Cyclin D1 protein was significantly decreased.ConclusionFn can stimulate the DNA-replikation of caco-2 cells via increasing the expression of c-Jun.

Fusobacterium nucleatum;Colorectal cancer;c-Jun;Caco-2 cells

R735.3

A

1006-5709(2017)08-0852-05

2017-04-05

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.004

廣州市胃腸病臨床醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化中心(00742)

曾利紅，碩士，研究方向:具核梭桿菌與結(jié)直腸癌。E-mail:455024851@qq.com

王紅，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:腸道菌群與結(jié)直腸癌。E-mail:wong.hong@163.com