冷 鳳，張 煒，田 威，張雪霞*

(1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；2.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

離子交換樹脂提取純化桿菌肽的工藝優(yōu)化

冷 鳳1，2，張 煒2，田 威1*，張雪霞2*

(1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；2.華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

首先比較了732、HZ016、D152、HD-2、D061、D001-CC、D296、D301等8種不同類型的離子交換樹脂對發(fā)酵液中桿菌肽的吸附和解吸效果，選出適合提取純化桿菌肽的樹脂；然后以交換容量和洗脫收率為指標，對交換pH值、交換流速和洗脫條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，大孔強酸型陽離子交換樹脂D061對桿菌肽的純化效果較好；最佳工藝條件為：交換pH值5.0～6.0，交換流速2.5 BV·h-1，先用0.5%氨水以流速0.5 BV·h-1洗脫2倍樹脂體積，再用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積，在此條件下，洗脫液中桿菌肽A含量可達66.2%，桿菌肽洗脫收率可達91%以上。所得洗脫液串聯(lián)凝膠型001X4陽離子交換樹脂柱進行脫鹽處理，再經(jīng)過脫色、萃取、結(jié)晶、干燥等精制步驟可得到生物效價高于74 U·mg-1的醫(yī)藥級桿菌肽原料藥。該工藝簡單可行，收率穩(wěn)定，純化效率高，為工業(yè)化生產(chǎn)桿菌肽奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)酵液；桿菌肽；離子交換樹脂；提取純化；工藝優(yōu)化

桿菌肽(bacitracin)，又名崔西桿菌素、枯草菌肽和亞枯草菌素，是一種多肽類抗生素。桿菌肽有多種異構(gòu)體，包括桿菌肽A、A1、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D、E、F、G等不同組分[1]，其中桿菌肽A的生物活性最高。桿菌肽最初的產(chǎn)生菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)[2]，目前桿菌肽主要由特雷斯氏枯草桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生。桿菌肽的抑菌作用較強，能夠較好地抑制革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌[3]。由于桿菌肽全身用藥時具有腎毒性，在臨床上應(yīng)用受到限制，僅限于治療由耐受青霉素的G+菌引起的耳、鼻、喉、眼、皮膚及口腔等局部感染[4]。美國藥典對醫(yī)藥級桿菌肽各組分含量有嚴格的規(guī)定，其中桿菌肽A含量不低于40%，桿菌肽B1、B2、B3、A含量之和不低于70%，桿菌肽F含量不高于6%。國產(chǎn)品由于達不到國外藥典標準，多用作動物飼料添加劑，大多應(yīng)用于仔豬、生長豬、種豬、肉雞、蛋雞及鴨，在牛、羊等反芻動物以及火雞、鴕鳥等特種動物上也可使用[5]，在水產(chǎn)動物中也有良好的作用效果[6]。此外，桿菌肽還可用作生物表面活性劑、食品防腐劑及生物學的研究手段[7]。

國內(nèi)關(guān)于桿菌肽在畜禽飼養(yǎng)方面應(yīng)用的文獻較多，但是關(guān)于提取工藝方面的報道很少。郭淑琴等[8]用離子交換法提取桿菌肽，所得產(chǎn)品生物效價僅為54U·mg-1。劉詠[9]用膜分離技術(shù)精制桿菌肽鋅鹽，所得產(chǎn)品生物活性也較低。國外對桿菌肽純化工藝研究較多，有吸附法[10]、沉淀法[11]、離子交換法[12-13]和有機溶劑萃取法[14-15]等。這些方法大多存在所得產(chǎn)品生物效價低、總收率低、使用大量有毒試劑對環(huán)境造成污染等缺點。

作者比較了不同類型的離子交換樹脂對發(fā)酵液中桿菌肽的吸附和解吸效果，篩選出適合提取純化桿菌肽的樹脂；并通過對交換條件和洗脫條件進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件，擬為工業(yè)化生產(chǎn)桿菌肽提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

桿菌肽發(fā)酵液由華北制藥集團研發(fā)中心發(fā)酵崗位提供。

苯乙烯系陽離子交換樹脂732、HZ016，上海華震科技有限公司；大孔弱酸型陽離子交換樹脂D152、HD-2，陰離子交換樹脂D296、D301，天津波鴻樹脂科技有限公司；大孔強酸型陽離子交換樹脂D061、D001-CC，凝膠型陽離子交換樹脂001X4，天津南開大學樹脂廠；乙腈(色譜純)，美國Merck公司；桿菌肽標準品、去離子水，自制；其它試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

pH計，梅特勒-托利多公司；循環(huán)水式多用真空泵、SXJQ-1型機械攪拌儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；高效液相色譜儀，日本島津公司；BS-30A型自動收集器，上海滬西分析儀器有限公司；恒溫電磁攪拌器，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為0.05 mol·L-1KH2PO4和0.05 mol·L-1K2HPO4·3H2O的水溶液，B為80 mL乙腈和1 040 mL甲醇混合溶液，A∶B=40∶60(體積比)；流速：1.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：桿菌肽A 254 nm，桿菌肽F 300 nm。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的預處理

向桿菌肽發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，攪拌10 min，真空抽濾，得桿菌肽濾液，采用HPLC法測定其效價，備用。

1.3.2 離子交換樹脂的篩選

1.3.2.1 離子交換樹脂的預處理與再生

新購樹脂置于燒杯中，用乙醇浸泡12 h，用去離子水反復洗滌至上清液無色無異味。用4倍樹脂體積的1 mol·L-1HCl溶液浸泡4 h，傾去上清酸液，用去離子水反復洗滌至中性；再用4倍樹脂體積的1 mol·L-1NaOH溶液浸泡4 h，傾去上清堿液，用去離子水反復洗滌至中性，備用。離子交換樹脂的物理參數(shù)見表1。

表1 離子交換樹脂的物理參數(shù)

Tab.1 Physical parameters of ion exchange resins

1.3.2.2 樹脂靜態(tài)吸附率和解吸率的測定

取預處理好的8種濕樹脂各10 mL置于250 mL三角瓶中，加入120 mL桿菌肽濾液于室溫下電磁攪拌過夜，達到吸附平衡后采用HPLC法測定吸附殘液效價，計算靜態(tài)吸附率。將吸附飽和的樹脂濾去殘液，用去離子水洗滌后，分別加入3%氨水80 mL靜置過夜，取上清液測定桿菌肽效價，并計算解吸率。

1.3.2.3 樹脂D061和D001-CC的吸附動力學曲線

取處理好的濕樹脂D061和D001-CC各10 mL置于500 mL三角瓶中，加入200 mL桿菌肽濾液于室溫下電磁攪拌，每隔10 min取樣一次，采用HPLC法測定吸附殘液效價，計算吸附率，繪制2種樹脂的吸附動力學曲線。

1.3.3 交換pH值的選擇

pH值是影響離子交換平衡的一個重要因素。pH值會影響溶液中物質(zhì)的帶電性，也會影響離子交換樹脂的交換容量。取7份桿菌肽濾液各200 mL，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。取7份處理好的濕樹脂D061各10 mL，置于500 mL三角瓶中，分別加入不同pH值的桿菌肽濾液，室溫下電磁攪拌進行交換，直至達到平衡，采用HPLC法測定吸附殘液效價，計算樹脂靜態(tài)交換容量。

1.3.4 交換流速的選擇

取5份處理好的濕樹脂D061各100 mL，裝5根相同的離子交換柱，柱子徑高比為1∶6。調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為6.0，上樣，分別控制流速為1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1、2.0 BV·h-1、2.5 BV·h-1、3.0 BV·h-1，當出口液桿菌肽濃度接近上樣液濃度5%時停止上樣，計算不同流速下樹脂D061的動態(tài)交換容量。

1.3.5 洗脫液濃度的選擇

調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為6.0，以最佳交換流速上5根D061樹脂柱至平衡。用去離子水以2.0 BV·h-1流速洗2倍柱體積，洗去水溶性雜質(zhì)和色素。分別配制濃度為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%氨水以0.5 BV·h-1流速洗脫樹脂柱，柱底端串聯(lián)凝膠型001X4陽離子交換樹脂柱進行脫鹽，采用HPLC法測定洗脫液中桿菌肽效價低于40 U·mL-1時停止洗脫。比較洗脫效果及洗脫收率。

1.3.6 洗脫流速的選擇

調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為5.5，以最佳交換流速上4根D061樹脂柱至平衡，用去離子水洗2倍柱體積，配制3.5%氨水，分別控制流速為0.25 BV·h-1、0.5 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1進行洗脫。用自動收集器收集洗脫液，每瓶25 mL，采用HPLC法測定洗脫液中桿菌肽效價。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子交換樹脂的篩選結(jié)果

2.1.1 樹脂靜態(tài)吸附率和解吸率測定結(jié)果(圖1)

圖1 樹脂對桿菌肽的靜態(tài)吸附率和解吸率

由圖1可知，各種類型的離子交換樹脂對桿菌肽的吸附能力和解吸能力大小順序為D061>D001-CC>HZ016>732>D152>HD-2>D301>D296。樹脂D061和D001-CC的靜態(tài)吸附率和解吸率都較高，原因是二者都為強酸型陽離子交換樹脂，桿菌肽易與樹脂上陽離子進行交換，其次二者都有大孔吸附性，桿菌肽較易進入樹脂內(nèi)部發(fā)生交換。因此，初步選擇D061和D001-CC從吸附動力學角度做進一步的比較。

2.1.2 樹脂D061和D001-CC的吸附動力學曲線(圖2)

圖2 樹脂D061和D001-CC的吸附動力學曲線

由圖2可知，D061和D001-CC的吸附率相差不大，但是D061的吸附速度比D001-CC快;而且從圖1可知D061的解吸率比D001-CC要略高一些，因此選擇樹脂D061提純發(fā)酵液中的桿菌肽。

2.2 交換pH值的確定

樹脂D061對不同pH值桿菌肽濾液的靜態(tài)交換容量見圖3。

圖3 樹脂D061對不同pH值濾液的靜態(tài)交換容量

由圖3可知，桿菌肽濾液pH值在5.0～6.0之間時，樹脂D061的靜態(tài)交換容量較高。因此，確定最佳交換pH值為5.0～6.0。

2.3 交換流速的確定

交換流速對樹脂D061動態(tài)交換容量的影響見圖4。

圖4 交換流速對樹脂D061動態(tài)交換容量的影響

由圖4可知，對樹脂D061而言，交換流速不超過2.5 BV·h-1時，交換流速對動態(tài)交換容量的影響不大；流速過快(3.0 BV·h-1)，動態(tài)交換容量明顯降低。綜合考慮，確定最佳交換流速為2.5 BV·h-1。

2.4 洗脫液濃度的確定

由于D061是大孔強酸型陽離子交換樹脂，交換條件偏弱酸性，宜選用弱堿性的氨水作為洗脫劑[16]。不同濃度氨水的洗脫情況見表2。

由表2可知，1.5%、2.5%氨水對樹脂D061的洗脫收率低，拖尾嚴重；而4.5%氨水濃度過高，會破壞原料，收率也較低；當氨水濃度為3.5%時，不僅解吸集中，洗脫收率還較高。另外發(fā)現(xiàn)，0.5%氨水雖然沒有解吸能力，但是可以洗下一些雜質(zhì)和色素。因此，確定解吸流程為：先用0.5%氨水洗脫2倍樹脂體積，再用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積。

表2 不同濃度氨水的洗脫情況

Tab.2 Elution conditions by different concentrations of ammonia

2.5 洗脫流速的確定

洗脫流速對效價影響見圖5，洗脫流速對桿菌肽A含量和洗脫收率的影響見表3。

圖5 洗脫流速對效價的影響

表3 洗脫流速對桿菌肽A含量及洗脫收率的影響

由圖5可知，洗脫流速慢，洗脫收率高，桿菌肽濃度集中；隨著洗脫流速的加快，桿菌肽濃度不集中，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。流速為0.25 BV·h-1時洗脫收率最高，解吸也最集中，但是由于流速較慢，洗下的雜質(zhì)較多，HPLC圖譜上顯示主峰純度并不好，其純化效果較流速0.5 BV·h-1要低。綜合考慮，確定最佳洗脫流速為0.5 BV·h-1。

2.6 樹脂D061提取純化桿菌肽的驗證實驗

按照實驗篩選出的優(yōu)化條件進行3批50 L發(fā)酵罐的小試實驗，以驗證工藝的可行性和穩(wěn)定性。用2.5 L D061樹脂柱從發(fā)酵液中提取純化桿菌肽，調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為6.0，以流速2.5 BV·h-1上樣；用5 L去離子水洗滌樹脂柱，用0.5%氨水以洗脫流速0.5 BV·h-1洗脫2倍樹脂體積，用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積；洗脫液串聯(lián)凝膠型001X4陽離子交換樹脂柱進行脫鹽，再經(jīng)過脫色、萃取、結(jié)晶、干燥等后續(xù)精制步驟，得到桿菌肽原料藥粉末，測定其生物效價。計算洗脫收率和提取總收率，結(jié)果見表4。

表4 小試工藝驗證實驗結(jié)果(n=3)

Tab.4 Verification experiment results of lab scale process(n=3)

由表4可知，采用樹脂D061提取純化桿菌肽，在最佳工藝條件下，洗脫收率可達91%以上，所得終產(chǎn)品生物效價超過74 U·mg-1，提取總收率超過60%。

3 結(jié)論

采用大孔強酸型陽離子交換樹脂D061提取純化桿菌肽發(fā)酵液，確定最佳交換條件為：桿菌肽濾液pH值5.0～6.0，流速2.5 BV·h-1；最佳洗脫條件為：先用0.5%氨水以流速0.5 BV·h-1洗脫2倍樹脂體積，再用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積。HPLC檢測結(jié)果顯示，面積歸一化法計算洗脫液中主峰桿菌肽A的含量可達66.2%，達到純化目的，洗脫收率可達91%以上，所得終產(chǎn)品的生物效價超過74 U·mg-1，物料體積縮小5～7倍，大大節(jié)省后續(xù)精制步驟中有機溶劑的使用量，為桿菌肽的精制打下基礎(chǔ)，也為工業(yè)化生產(chǎn)醫(yī)藥級桿菌肽原料藥提供理論依據(jù)。

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Optimization in Extraction and Purification of Bacitracin by Ionic Exchange Resin

LENG Feng1,2,ZHANG Wei2,TIAN Wei1*,ZHANG Xue-xia2*

(1.ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.NewDrugResearch&DevelopmentCompanyofNCPC,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,Shijiazhuang050015,China)

Wefirstlycomparedtheadsorptionanddesorptionefficienciesofeightkindsofionicexchangeresins，namely732,HZ016,D152,HD-2,D061,D001-CC,D296,andD301onbacitracininfermentationbroth，andselectedthesuitableresinforextractionandpurificationofbacitracin.Then,weoptimizedexchangepHvalue,exchangeflowrate,andelutionconditionsbyusingexchangecapacityandelutionyieldasindexes.ResultsshowedthatmacroporousstrongacidcationexchangeresinD061wasthebestonetoextractandpurifybacitracin.Theoptimalprocessconditionswereasfollows:exchangepHvaluewas5.0～6.0,exchangeflowratewas2.5BV·h-1,eluting2timesoftheresinvolumewith0.5%ammoniawithflowrateof0.5BV·h-1firstly,theneluting3timesoftheresinvolumewith3.5%ammonia.Underaboveconditions,thecontentofbacitracinAineluentreached66.2%,andelutionyieldreachedover91%.Afterdesalinationbygeltypecationexchangeresin001X4,andfollowingpurificationstepssuchasdecolorization,extraction,crystallization,anddrying,weobtainedpharmaceuticalgradebacitracinwiththetiterof74U·mg-1.Theprocessiseasyandfeasiblewithstableyieldandhighpurificationefficiency,whichlaysatheoreticalfoundationforindustrialproductionofbacitracin.

fermentationbroth;bacitracin;ionicexchangeresin;extractionandpurification;processoptimization

河北省科技條件建設(shè)項目(169676404G)

2017-04-25

冷鳳(1981-)，女，黑龍江海林人，工程師，研究方向：微生物來源藥物的分離、純化、結(jié)晶，E-mail：214824557@qq.com；通訊作者：田威，副教授，E-mail：tianweiww@sina.com；張雪霞，教授級高級工程師，E-mail：zhangxuexiazxx@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.013

TQ028

A

1672-5425(2017)08-0063-05

冷鳳，張煒，田威，等.離子交換樹脂提取純化桿菌肽的工藝優(yōu)化[J].化學與生物工程，2017，34(8)：63-67.