楊冬靜, 張成玲，徐 振，趙永強(qiáng)，孫厚俊，謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131)

一株解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

楊冬靜, 張成玲，徐 振，趙永強(qiáng)，孫厚俊，謝逸萍*

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131)

從土壤中分離篩選到一株具有廣譜抗菌活性的拮抗細(xì)菌，命名為XZ-1。采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定其抑菌活性，結(jié)果顯示：XZ-1對(duì)大蒜葉枯病菌、草莓炭疽病菌等8種重要農(nóng)作物病害的病原真菌均具有較強(qiáng)的拮抗活性，且抑菌帶直徑均大于10 mm。采用PCR擴(kuò)增16S rDNA片段并用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明XZ-1與解淀粉芽孢桿菌16S rDNA序列KY828923聚為一簇，因此初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)XZ-1的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：XZ-1在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最佳，在氯化鈉濃度為0～10 g/L之間時(shí)生長(zhǎng)情況相對(duì)較好；對(duì)光暗不敏感，致死溫度為100 ℃、10 min。

解淀粉芽孢桿菌；拮抗活性；生物學(xué)特性

化學(xué)藥劑在病害防治中起到重要作用，但生產(chǎn)上頻繁和高濃度地使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留增加和環(huán)境污染問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人類健康。隨著人們對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)品質(zhì)量和安全性的日益重視，化學(xué)藥劑對(duì)人類的危害已成為關(guān)注焦點(diǎn)，對(duì)植物病害采取生物防治逐漸成為一種新的發(fā)展趨勢(shì)[1-3]。

生物防治避免了化學(xué)藥劑帶來(lái)的一系列環(huán)境問(wèn)題，其最大的優(yōu)點(diǎn)是不污染環(huán)境，這是化學(xué)防治所不能比的；其次，生防因子廣泛存在于自然界，對(duì)人畜安全，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，還有一些生防菌具有降解農(nóng)藥的特性，可降低農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量，因此，生物防治已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外植?？蒲泄ぷ髡叩难芯繜狳c(diǎn)，每年有大量有關(guān)生防菌株篩選鑒定、防治效果以及生防菌作用機(jī)理等的報(bào)道[4-5]。

生防細(xì)菌繁殖速度快，通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)根圍營(yíng)養(yǎng)和根部侵染空間位點(diǎn)，或分泌抗菌物質(zhì)抑制多種病原菌的生長(zhǎng)和擴(kuò)展，或通過(guò)觸發(fā)植物中水楊酸、茉莉酸或乙烯信號(hào)通路誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，引起植物體內(nèi)各種生理生化變化，如植物防御酶系的表達(dá)、病程相關(guān)蛋白的積累等，從而達(dá)到抵御病原菌侵染的目的[6-7]。關(guān)于生防菌株產(chǎn)業(yè)化的報(bào)道也較多，如德國(guó)ABiTEP GmbH 公司對(duì)解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens FZB42進(jìn)行全基因組測(cè)序，并已有諸多的研究成果報(bào)道，F(xiàn)ZB42生防促生微生物制劑已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所開(kāi)發(fā)的枯草芽孢桿菌“紋曲寧”對(duì)于水稻紋枯病菌和稻曲病菌具有較好的防治效果[8-11]。目前，江蘇徐淮地區(qū)關(guān)于生防菌株篩選以及主要農(nóng)作物病害生物防治的研究報(bào)道罕見(jiàn)。本課題組采集土壤樣本，分離、篩選優(yōu)良拮抗細(xì)菌，研究了其對(duì)引起主要農(nóng)作物病害的病原菌的拮抗作用，以期為農(nóng)作物病害提供新的生防菌株，并為生防菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試真菌 供試病原真菌中甘薯干腐病菌和大蒜葉枯病菌由本課題組分離和保存；草莓炭疽病菌、絲瓜炭疽病菌、小麥全蝕病菌、大豆菌核病菌、甜瓜枯萎病菌以及小麥紋枯病菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)殺菌劑課題組饋贈(zèng)。

1.1.2 細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基 生防菌菌株分離篩選及培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L)，對(duì)病原菌的拮抗活性測(cè)定使用PDA培養(yǎng)基(土豆20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L)。

1.2 拮抗菌分離

2016年10月從江蘇徐州市銅山區(qū)班井村甘薯種植地、周圍蔬菜地以及果園地果樹(shù)根際土壤采集土樣共36份。每份土樣稱取10 g，分別放入裝有90 mL無(wú)菌水和玻璃珠的三角瓶中，采用搖床振蕩15～30 min，待土樣充分混勻后，用移液槍分別吸取1 mL土樣懸浮液，加入盛有9 mL無(wú)菌水的試管后充分混勻，即為10-2倍土樣稀釋液；采用同樣的方法，依次制備10-3、10-4、10-5、10-6倍土樣稀釋液。將制備好的各梯度倍數(shù)的土樣稀釋液分別取100 μL均勻涂布在LBA平板中，封上Parafilm封口膜，平板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以上。觀察生長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落的顏色、形態(tài)、透明度等特征，并挑取平板中不同特征的菌落重新純化，將獲得的純培養(yǎng)移入LBA斜面，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 拮抗活性測(cè)定

將篩選到的菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)24 h后獲得發(fā)酵液備用。采用平板對(duì)峙法[12]測(cè)定生防細(xì)菌的拮抗活性，詳細(xì)操作步驟不再贅述，待對(duì)照中兩病原菌菌絲交接時(shí)，記錄抑菌帶直徑，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.4 16S rDNA序列片段擴(kuò)增及分析

采用基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)提取XZ-1基因組DNA。細(xì)菌16S rDNA 片段擴(kuò)增通用引物序列如下：27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3′)[13]。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)32次；再在72 ℃條件下延伸5 min后終止反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：基因組DNA模板1 μL，ddH2O 10 μL，KOD酶1 μL，dNTP 10 μL，KOD buffer 25 μL，27F 1.5 μL，1492R 1.5 μL。0.8%瓊脂糖凝膠電壓100 V電泳檢測(cè)后，將有特異性條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行測(cè)序。將所測(cè)序列與在NCBI中已知的序列進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析，采用MEGA 6.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值取1000，以此初步確定該拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.5 XZ-1的生物學(xué)特性研究

1.5.1 pH值對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響 用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的pH值，設(shè)5、6、7、8、9、10、11和12等8個(gè)梯度。用三角瓶分別取25 mL調(diào)節(jié)pH后的培養(yǎng)基；將活化好的XZ-1菌液50 μL接種到各培養(yǎng)基中，每處理均設(shè)3次重復(fù)，28 ℃、180 r/min搖培24 h后記錄OD600。

1.5.2 氯化鈉濃度對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響 以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中NaCl稱取量分別設(shè)置成0、5、10、15、20和25 g/L等6個(gè)梯度；將活化好的XZ-1菌液50 μL分別接種到各不同氯化鈉濃度的液體培養(yǎng)基中，每處理均設(shè)3次重復(fù)，28 ℃、180 r/min搖培24 h后記錄OD600。

1.5.3 光照條件對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響 將活化好的XZ-1菌液50 μL接種到LB液體培養(yǎng)基中，分別設(shè)置光照、黑暗和12 h光照12 h黑暗光暗交替3個(gè)處理，每處理均設(shè)3次重復(fù)，28 ℃、180 r/min搖培24 h后記錄OD600。

1.5.4 XZ-1致死溫度測(cè)定 設(shè)置45、50、55、60、65、70、75、80、90和100 ℃共10個(gè)溫度梯度，無(wú)菌條件下取100 μL活化好的菌液置入1.5 mL滅菌離心管中蓋好，分別置于以上各梯度溫度的水浴鍋中水浴10 min，然后取出涂板，觀察有無(wú)菌落長(zhǎng)出，根據(jù)菌落生長(zhǎng)與否，確定致死溫度。

1.5.5 XZ-1生長(zhǎng)對(duì)氧氣的需求 采用深層瓊脂法[14]，首先制備XZ-1發(fā)酵液，備用；然后取溶化的LBA培養(yǎng)基裝入滅菌試管中，100 ℃水浴使培養(yǎng)基保持不凝固的狀態(tài)；將試管取出，在室溫條件下冷卻至45～50 ℃；再吸取100 μL發(fā)酵液加入試管中，快速搓動(dòng)試管使菌液均勻分布于培養(yǎng)基，然后將試管置于冰浴中以便于瓊脂迅速凝固。將接種好菌液的試管置于28 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。試驗(yàn)重復(fù)3次，2 d后觀察菌體在試管中的生長(zhǎng)部位，直到10 d后結(jié)果基本清晰為止。根據(jù)細(xì)菌在試管中的生長(zhǎng)部位，判斷該菌株對(duì)氧氣的需求能力，將其分為以下5 種類型：耐氧厭氧菌在試管培養(yǎng)基中均勻生長(zhǎng)；專性厭氧菌只在試管培養(yǎng)基底部生長(zhǎng)；兼性厭氧菌在試管培養(yǎng)基接近表面及上部生長(zhǎng)旺盛，但是在試管中下部也有少量生長(zhǎng)；微好氧菌在試管培養(yǎng)基中部生長(zhǎng)；好氧菌只在試管培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌分離

37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，挑取平板中顏色和菌落形態(tài)不同的單菌落劃線純化，得到了6個(gè)細(xì)菌純培養(yǎng)用于后續(xù)的拮抗活性測(cè)定。

2.2 抑菌譜測(cè)定

待對(duì)照中兩病原菌菌絲長(zhǎng)到平板中央時(shí)，記錄抑菌帶直徑。結(jié)果顯示分離出的6個(gè)菌株中，其中一個(gè)菌株抑菌譜廣，抑菌活性較強(qiáng)，故將其命名為XZ-1。如圖1所示，XZ-1對(duì)8種指示植物病原真菌均有較強(qiáng)的抑制效果，均顯示出了非常明顯的抑菌帶。抑菌帶直徑測(cè)定結(jié)果如表1所示，XZ-1對(duì)大蒜葉枯病菌和絲瓜炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，其抑菌帶直徑分別為21.1 mm和22.7 mm；對(duì)草莓炭疽病菌等其他6種病原真菌的抑菌效果其次，但其抑菌帶直徑均大于10.0 mm。

A、B、C、D、E、F、G、H的指示病原菌分別為大蒜葉枯病菌、草莓炭疽病菌、甘薯干腐病菌、絲瓜炭疽病菌、甜瓜枯萎病菌、小麥全蝕病菌、小麥紋枯病菌及大豆菌核病菌。每個(gè)圖中左邊平板為對(duì)照，右邊平板為XZ-1處理。

圖1 XZ-1的拮抗活性測(cè)定結(jié)果

2.3 16S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增XZ-1菌株的16S rDNA片段，電泳檢測(cè)出約為1400 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。經(jīng)測(cè)序后序列比對(duì)以及構(gòu)建的基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

如圖3所示，XZ-1菌株與解淀粉芽孢桿菌聚為一簇，由此，我們初步將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖2 XZ-1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3 基于16S rDNA 序列的XZ-1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.4 XZ-1的生物學(xué)特性

2.4.1 pH 值對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響 在pH為5、6、7、8、9、10、11和12等8個(gè)梯度的LB液體培養(yǎng)基中，XZ-1在pH為5、6、7、8的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，其OD600分別為0.685、0.710、0.584、0.541；在pH為9的條件下生長(zhǎng)較差，其OD600為0.200；在pH為10、11、12條件下基本不生長(zhǎng)，其OD600分別為0.052、0.056、0.052(圖4)。

圖4 不同pH值對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響

2.4.2 氯化鈉濃度對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響 如圖5所示，XZ-1隨著氯化鈉濃度的增加，其生長(zhǎng)先加快后逐漸被抑制。在供試的6種氯化鈉梯度濃度的LB液體培養(yǎng)基中，XZ-1在氯化鈉濃度為5 g/L時(shí)生長(zhǎng)情況相對(duì)較好，其OD600為0.900；在氯化鈉濃度為10～25 g/L時(shí)，XZ-1隨著鹽濃度的升高生長(zhǎng)逐漸被抑制。

圖5 不同Nacl濃度對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響

2.4.3 光照條件對(duì)XZ-1生長(zhǎng)的影響 從圖6可以看出，XZ-1在不同的光照和黑暗處理方式下生長(zhǎng)狀況無(wú)較大差異，其OD600分別為0.800、0.792、0.821?？傮w而言，XZ-1菌株對(duì)光照的敏感性不強(qiáng)。

1：12 h光照和12 h黑暗；2：24 h光照；3：24 h黑暗。

2.4.4 XZ-1的致死溫度 調(diào)查結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)90 ℃及以下溫度水浴處理10 min 后涂板，在LBA 培養(yǎng)基上仍能長(zhǎng)出菌落；而經(jīng)過(guò)100 ℃、10 min處理后涂板，在LBA 培養(yǎng)基上看不到菌落的形成。由此確定該菌株的致死溫度為100 ℃、10 min。

2.4.5 XZ-1生長(zhǎng)對(duì)O2的需求 從48 h后開(kāi)始觀察XZ-1在試管內(nèi)的生長(zhǎng)狀況，直至10 d，結(jié)果均顯示XZ-1在試管培養(yǎng)基接近表面及上部生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)基中下部也有少量生長(zhǎng)，由此鑒定該菌株為兼性厭氧菌。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，解淀粉芽孢桿菌是研究生物防治的熱門菌種之一，由于其能夠分泌多種抑菌物質(zhì)[15]，有顯著的促生作用[16]，并且具有誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗性能力等優(yōu)點(diǎn)已得到廣泛的應(yīng)用與報(bào)道[17-21]。本研究從36份土樣中篩選出6株拮抗細(xì)菌，其中菌株XZ-1抑菌效果顯著且抑菌譜廣。平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，XZ-1的發(fā)酵液對(duì)供試的8種重要農(nóng)作物病害的病原菌有非常顯著的抑菌活性，其抑菌圈均大于10 mm。經(jīng)16 S rDNA片段擴(kuò)增以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，初步將該細(xì)菌鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。進(jìn)一步的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，XZ-1在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最佳，在pH值為8時(shí)仍然能夠較好地生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株具有較好的耐弱堿能力；在氯化鈉濃度為0～10 g/L之間的生長(zhǎng)情況相對(duì)較好，在氯化鈉濃度為25 g/L時(shí)，OD600仍然能達(dá)到0.579，表明該菌株具有較好的耐鹽性；致死溫度為100 ℃、10 min，表明該菌株具有較好的高溫抗性。由此，該生物學(xué)特性研究結(jié)果可為XZ-1的應(yīng)用環(huán)境條件奠定理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本課題組篩選出的生防菌株解淀粉芽孢桿菌XZ-1具有抑菌能力強(qiáng)、抑菌范圍廣、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，尤其比較適合于高溫高鹽以及中性、弱堿性土壤地區(qū)的應(yīng)用推廣。進(jìn)一步探索該菌株的田間防治效果以及抑菌機(jī)理，可為開(kāi)發(fā)新的生防菌劑奠定理論基礎(chǔ)，為農(nóng)作物病害生物防治作出貢獻(xiàn)。

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(責(zé)任編輯：許晶晶)

Isolation and Identification of A Strain ofBacillusamyloliquefaciensand Its Biological Characteristics

YANG Dong-jing, ZHANG Cheng-ling, XU Zhen, ZHAO Yong-qiang, SUN Hou-jun, XIE Yi-ping*

(Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area of Jiangsu / Key Laboratory of Sweet Potato Biology and Genetic Improvement, Ministry of Agriculture, Xuzhou 221131, China)

In this study, we isolated a strain of antagonistic bacterium with broad-spectrum antimicrobial activity from soil, which was named as XZ-1. The antagonistic activity of XZ-1 was tested by using the method of plate confrontation culture, and the results showed that XZ-1 had strong antagonistic activity against eight kinds of plant pathogenic fungi, such asPleosporaherbarum,Colletotrichumfragariaeand so on, and the diameter of inhibition zone was all more than 10 mm. The 16S rDNA fragment of XZ-1 was amplified by PCR, its phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0, and this strain was preliminarily identified asBacillusamyloliquefaciens. Single-factor experimental design was adopted to study the biological characteristics of XZ-1, and the results indicated that: the best pH-value for the growth of XZ-1 was 6, and the suitable salinity for its growth was 0～10 g/L sodium chloride; XZ-1 was not sensitive to light and darkness; the lethal temperature was 100 ℃ for 10 min.

Bacillusamyloliquefaciens; Antagonistic activity; Biological characteristics

2017-05-14

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-11-B-09)。

楊冬靜(1983─)，女，四川射洪人，助理研究員，碩士，主要從事植物病理學(xué)研究。*通訊作者：謝逸萍。

S476

A

1001-8581(2017)09-0069-06