李 蒙，鮑 鋒

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

不同植物無色花青素還原酶及其基因的生物信息學(xué)分析

李 蒙，鮑 鋒

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

對(duì)9種不同植物的無色花青素還原酶及其基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索該蛋白的結(jié)構(gòu)并預(yù)測(cè)LAR的功能。通過生物信息學(xué)軟件對(duì)GenBank中已經(jīng)登錄的不同植物L(fēng)AR基因和氨基酸序列進(jìn)行分析，對(duì)其組成成分、理化性質(zhì)、翻譯后修飾位點(diǎn)、功能域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、分子進(jìn)化等進(jìn)行預(yù)測(cè)和推斷。結(jié)果表明，9種植物無色花青素還原酶基因全長在1.0～1.2 kb，編碼342～391個(gè)氨基酸，不具有信號(hào)肽；9種植物L(fēng)AR都具有蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和N-端肉豆蔻?；稽c(diǎn)，個(gè)別植物L(fēng)AR具有N-端糖基化位點(diǎn)、酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)和cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)；二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主；進(jìn)化分析表明禾本科的玉米與其他科植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

無色花青素還原酶；生物信息學(xué)；結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；功能分析

無色花青素還原酶(Leucoanthocyanidin reductase, LAR, EC 1.17.1.3)是植物黃酮類化合物合成路徑中一個(gè)關(guān)鍵酶，在苯丙氨酸代謝通路中，其催化無色花青素轉(zhuǎn)化為兒茶素[1]，而兒茶素是具有重要生理活性的次生代謝產(chǎn)物，具有如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌活性等多種功效[2-4]。

在多種植物中研究發(fā)現(xiàn)兒茶素的積累與LAR基因的表達(dá)相關(guān)[5-7]。目前在GenBank數(shù)據(jù)庫中登陸的植物L(fēng)AR的基因序列有1000多條，已從葡萄[6]、蘋果[8]、豆類[9]、苜蓿[10]等植物中分離出不同拷貝數(shù)的LAR基因，而LAR的活性也已經(jīng)在大麥[11]、豆類[12]、茶樹[13]等植物中得到鑒定。LAR在兒茶素合成途徑中尤為重要[14]，有研究發(fā)現(xiàn)植物兒茶素的積累與LAR的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)[5]，并且受種內(nèi)和種間差異的明顯影響[15]。因此，探討LAR基因的表達(dá)調(diào)控及酶的功能特性具有重要的科學(xué)意義。

隨著大多數(shù)兒茶素合成路徑中相關(guān)酶的基因得到分離與克隆[16]，在后續(xù)基因的表達(dá)調(diào)控的研究中，將有利于進(jìn)一步了解植物生長發(fā)育過程中黃酮類物質(zhì)的積累過程。本文通過生物信息學(xué)方法，對(duì)不同植物L(fēng)AR基因及其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與特征進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析，以期為研究LAR家族蛋白的生化特性和調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在NCBI中查詢9種不同植物的無色花青素還原酶的核酸序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列：玉米(NM-001155409)、苦蕎(KC404849)、蘋果(DQ139837)、葡萄(NM-001281160)、茶樹(EF205148)、西洋梨(DQ251190)、草莓(JX134096)、大豆(JF433916)、玫瑰(KP768080)作為研究對(duì)象。

1.2 方法

(1)不同植物L(fēng)AR核苷酸與氨基酸序列分析與比對(duì)采用DNAStar、ClustalX2和genedoc軟件；(2)蛋白分子量、等電點(diǎn)、半衰期和穩(wěn)定性等重要理化性質(zhì)分析采用ProtParam；(3)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、分泌信號(hào)肽等采用TargetP 和SignalP 4.0，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SOPMA；(4)蛋白質(zhì)糖基化采用NetNGlyc在線分析，脂?；⒘姿峄?、cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)采用Motif Scan；(5)多重序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用ClustalX 2.0和TreeView。

2 結(jié)果與分析

2.1LAR基因與氨基酸序列理化性質(zhì)分析

利用DNAStar和ProtParam在線分析，結(jié)果如表1所示，9種植物L(fēng)AR基因的ORF全長在1029～1176 bp之間，GC含量適中(除玉米外)，其氨基酸數(shù)目在342～391，分子量36.92～43.30 kD，pI值在5.16～6.38，說明LAR呈酸性，與酸堿氨基酸比例結(jié)果一致。經(jīng)ProParam分析氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)氨基酸Val在所有植物L(fēng)AR中含量較高，比例在7.1%～9.9%；氨基酸Ile、Ala在大多數(shù)植物L(fēng)AR中含量較高；氨基酸Trp和Gln在所有植物L(fēng)AR中含量較低。所有植物L(fēng)AR蛋白質(zhì)中負(fù)電荷氨基酸殘基比例高于正電荷氨基酸殘基比例，疏水氨基酸比例高于酸性、堿性和極性氨基酸比例，LAR在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為28.86～49.28，除苦蕎外均低于閥值(<40為穩(wěn)定蛋白)，推測(cè)LAR為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為89.23～96.88，親水性平均系數(shù)為-0.258～0.036，說明LAR蛋白質(zhì)總體親水性較低。

表1 9種植物中LAR核苷酸及氨基酸序列組成和理化性質(zhì)

2.2 LAR氨基酸序列比對(duì)分析

不同植物的LAR氨基酸序列經(jīng)ClustalX 2.0比對(duì)后，除了玉米，其他植物的LAR氨基酸序列同源性較高，都存在RFLP、ICCN和THD結(jié)構(gòu)域(圖1)，推斷不同植物中LAR的活性差異可能與保守結(jié)構(gòu)域中個(gè)別氨基酸的替換相關(guān)。

2.3 LAR翻譯后修飾與功能位點(diǎn)分析

植物蛋白質(zhì)序列分析對(duì)其生物學(xué)功能的確定具有重要意義。9種植物蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)表明(表2)，通過NetNGlyc在線N-糖基化位點(diǎn)分析，玉米、葡萄、茶樹和玫瑰4種植物的LAR蛋白含有不同的糖基化位點(diǎn)(玉米270NNTV、葡萄227NKSL、茶樹50NKTL和212NKSV、玫瑰229NLSD)，說明這些蛋白質(zhì)只能在真核生物中翻譯才具有生物學(xué)功能。通過Motif Scan預(yù)測(cè)cAMP和cGMP依賴蛋白激酶、脂?；龋兄参風(fēng)AR蛋白都具有蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和N端肉豆蔻?；稽c(diǎn)，而酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)的修飾唯有玉米LAR蛋白含有，cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化唯有苦蕎蛋白序列(343KKQS和361KKRS)和大豆蛋白序列(355KKCS)位點(diǎn)修飾。

2.4 蛋白的亞細(xì)胞定位和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

TargetP在線分析表明(表3)，信號(hào)肽預(yù)測(cè)分值為0.012～0.618，cutoff值為0.430，說明9種植物L(fēng)AR蛋白不存在信號(hào)肽，其結(jié)果與Signal P 4.0預(yù)測(cè)的結(jié)果相符；亞細(xì)胞定位分析表明，線粒體定位預(yù)測(cè)值為0.071～0.652，定位于其他位置的預(yù)測(cè)值為0.058～0.548；經(jīng)SOPMA對(duì)LAR進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明(表3)，不同植物L(fēng)AR二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋所占比例為30.39%～43.73%，β折疊所占比例為8.16%～11.11%，無規(guī)則卷曲所占比例為29.26%～38.00%，延伸鏈所占比例為16.91%～24.85%，說明LAR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

黑色和灰色分別表示氨基酸的相似性；方框標(biāo)明保守結(jié)構(gòu)域。物種名分別為GmLAR：大豆(Glycinemax)；CsLAR：茶樹(Camelliasinensis)；PcLAR：西洋梨(Pyruscommunis)；MdLAR：蘋果(MalusXdomestica)；FaLAR：草莓(Fragariaxananassa)；RrLAR：玫瑰(Rosarugosa)；FtLAR：苦蕎(Fagopyrumtataricum)；VvLAR：葡萄(Vitisvinifera)；ZeLAR：玉米(Zea)。

圖1 多重氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.5 進(jìn)化分析

利用ClustalX 2.0和TreeView對(duì)不同植物的LAR進(jìn)行氨基酸的進(jìn)化分析，結(jié)果表明(圖2)，不同植物L(fēng)AR在進(jìn)化過程中，禾本科的玉米LAR與其他科植物L(fēng)AR距離較遠(yuǎn)，親緣性較遠(yuǎn)；薔薇科的西洋梨、蘋果、草莓和玫瑰LAR相聚為一個(gè)分支，說明親緣性較近；而蓼科的苦蕎、豆科的大豆、葡萄科的葡萄和山茶科的茶樹LAR具有親緣性。進(jìn)化分析與LAR氨基酸序列比對(duì)結(jié)果相符。

圖2 不同植物L(fēng)AR的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

植物兒茶素代謝路徑中LAR屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族和PIP家族[17]，在植物中普遍存在并參與多種生長發(fā)育調(diào)控。隨著不同植物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的開展，生物信息學(xué)的發(fā)展為功能基因組學(xué)的研究開辟了更加便利的手段，通過對(duì)克隆的基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，有助于揭示物種基因的進(jìn)化，發(fā)掘蛋白質(zhì)功能，為遺傳育種篩選經(jīng)濟(jì)性狀和抗性候選基因提供一定的理論依據(jù)。

本文通過一系列生物信息學(xué)方法對(duì)9種植物兒茶素類化合物合成關(guān)鍵酶LAR的核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9種植物L(fēng)AR核酸組成中G+C的含量正常(除玉米偏高外)?；蛐蛄蠫+C含量直接影響mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及其熱力學(xué)穩(wěn)定性，最終會(huì)影響植物組織中LAR的轉(zhuǎn)錄和翻譯，比如外源基因G+C含量(40%～50%)要與畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)要求相一致，才能確保成功表達(dá)[18]。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生理功能；而蛋白質(zhì)的糖基化修飾能夠調(diào)控其在組織和細(xì)胞中的定位、活性與功能，是參與蛋白質(zhì)功能的主要修飾手段，其位點(diǎn)的變異與疾病的發(fā)生可能有關(guān)[19]；同樣蛋白質(zhì)磷酸化修飾能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中離子通道和改變激酶的活性，改變基因的表達(dá)，在一定程度上影響細(xì)胞的再生和分化[20]；蛋白質(zhì)的二級(jí)或空間結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)行使其功能密切相關(guān)；進(jìn)化關(guān)系分析可以為植物的繁殖與育種提供理論依據(jù)。

植物黃酮類物質(zhì)的生物活性功能不斷被發(fā)掘，以及在未來醫(yī)藥領(lǐng)域開闊的市場前景[21]，其黃酮類物質(zhì)代謝相關(guān)酶的基因得到克隆，后續(xù)可能利用基因工程手段改良植物品種，篩選代謝產(chǎn)物累積相關(guān)基因，研究其表達(dá)調(diào)控模式具有重要的意義。

表2 翻譯后修飾和結(jié)構(gòu)特征性序列分析結(jié)果

注：“N-端糖基化位點(diǎn)”和“蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)”的閥值均為0.5。

表3 亞細(xì)胞定位及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析結(jié)果

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(責(zé)任編輯：許晶晶)

Bioinformatics Analysis of Leucoanthocyanidin Reductase and Gene in Different Plants

LI Meng, BAO Feng

(College of Biological and Environmental Engineering, Xi’an University of Arts and Sciences, Xi’an 710065, China)

The leucoanthocyanidin reductase (LAR) and its gene in nine kinds of plants were analyzed by using bioinformatic method. The nucleic acid sequences and amino acid sequences of LARs registered in GenBank were analyzed by using bioinformatic software, and their compositions, physical and chemical properties, post-translational modification sits, functional domains, secondary structure, subcellular location and molecular phylogenetic evolution were predicted and inferred. The results demonstrated that the LAR genes in nine kinds of plants was 1.0～1.2 kb in overall length, and they coded 342～391 amino acids, but had no signal peptide. All LARs had protein kinase C phosphorylation sites, casein kinase Ⅱ phosphorylation sites and N-myristoylation sites, and the LAR in several plants also had N-glycosylation sites, tyrosine kinase phosphorylation sites, and cAMP-dependent and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites. The secondary structure mainly was of alpha helix and random coil. The evolutionary tree showed that the gramineous maize and the plants in other families had a distant genetic relationship.

Leucoanthocyanidin reductase; Bioinformatics; Structural prediction; Functional analysis

2017-05-14

李蒙(1988─)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

Q811.4

A

1001-8581(2017)09-0005-05