楊思廣 費(fèi)麗娜 畢 娜

《正骨先行散》藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

楊思廣 費(fèi)麗娜 畢 娜

目的就正骨先行散的原材料檢驗方法及注意事項進(jìn)行分析。方法通過顯微鑒別、薄層色譜分別對三七、龍血竭等中藥成分進(jìn)行鑒別，鑒別的過程進(jìn)行系統(tǒng)剖析，并對鑒別過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重點(diǎn)步驟做歸納和總結(jié)。結(jié)果茯苓、三七、龍血竭等中藥成分顯微鑒別特征明顯，三七、龍血竭、紅花等中藥成分薄層色譜結(jié)果重復(fù)性良好。結(jié)論該方法簡便易行，準(zhǔn)確可靠，可用于正骨先行散的質(zhì)量控制。

正骨先行散；顯微鑒別；薄層色譜；三七；龍血竭；當(dāng)歸

正骨先行散是由紅花、龍血竭等中藥成分組成的醫(yī)院自制純中藥制劑，具有活血行氣、消腫、潤腸、止痛之功效，主要用于骨折初期，在臨床中有較好的療效。為有效控制其質(zhì)量，根據(jù)該品種的藥味及制法，對茯苓、三七、龍血竭等中藥成分采用顯微鑒別，用薄層色譜法對三七、龍血竭、紅花等中藥成分進(jìn)行定性鑒別。

1 試劑與試藥

1.1 樣品實驗所用的中成藥、陰性對照來源均由某醫(yī)院提供。正骨益中散，批號：20150715-1、20150715-2、20150715-3。

1.2 對照品人參皂苷 Rb1，批號：110704-200318（含量測定用）；人參皂苷Rg1，批號：110703-200425（含量測定用）；三七皂苷 R1，批號：0745-200109（含量測定用）；龍血竭，批號：121252-201303；延胡索乙素，批號：110726-200107（含量測定用）；紅花，批號：120907-201412；當(dāng)歸，批號：120927-200613，上述對照品均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.3 薄層板硅膠G預(yù)制板、硅膠H預(yù)制板由青島海洋化工廠分廠提供。薄層色譜所用試劑均為分析純。

1.4 原料來源

1.4.1 三七五加科植物三七 Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen去除水分的根及根莖。秋日開花前采集，清洗，將主根和支根以及根莖分開，進(jìn)行干燥處理。支根俗稱“筋條”，根莖俗稱“剪口”[1]，清熱、平肝、降壓，也適用于心腦血管疾病的治療[2]。

1.4.2 龍血竭百合科植物劍葉龍血樹Dranaena cochinchinensis（Lour.）S.C.Chen含酯木材，其經(jīng)提取得到的樹脂[1]。

1.4.3 紅花菊科植物紅花 Carthamus tinctorius L.干制花。每年夏日花從黃轉(zhuǎn)為紅色時采收，進(jìn)行陰干、曬干[1]。

1.4.4 當(dāng)歸本品為傘形科植物當(dāng)歸 Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根[1]。研究表明，當(dāng)歸及其有效成分藁本內(nèi)酯類、香豆素類、黃酮類、有機(jī)酸及氨基酸等[3]。

1.4.5 乳香為橄欖科植物乳香樹Boswellia carterii Birdw.及其同屬植物Boswellia bhaw-dajiana Birdw.收集樹皮溢出樹脂。

1.4.6 延胡索系罌粟科植物延胡索 Corydalis yanhusuo W.T.Wang干燥的塊狀莖。含近20種生物堿：D-紫堇堿（D-Corgdaline，即延胡索甲素）、DL-四氫巴馬亭（DL-Tetrahydropalmatine，即延胡索乙素）、后鴉片堿（Protopine，即延胡索丙素）、L-四氫黃連堿（L-Tetrahydrocoptisine，即延胡索丁素）等[4]。

1.4.7 茯苓系多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf干燥的菌核。

1.4.8 桃仁為薔薇科植物桃Prunus persica（L.）Batsch 或山桃Prunus davidianan（Carr.）Franch.成熟后干燥的種子。桃仁含苦杏仁甙（Amygdalin），含量約為苦杏仁的1/2，并含苦杏仁酶（Emulsin）、尿囊素酶（Allontoinse）、乳糖酶、維生素B1及多量脂肪油[5]。

1.4.9 枳殼系為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.以及栽培變種經(jīng)干燥處理的未成熟果實。

2 方法與結(jié)果

根據(jù)該品種的處方藥味及制法，擬依次進(jìn)行顯微、薄層色譜法定性鑒別，列入【鑒別】（1）（2）（3）（4），以確保該藥物的內(nèi)在質(zhì)量。

2.1 顯微鑒別

2.1.1 三七顯微特征可觀察到較多的淀粉粒，顆?？沙蕡A、半圓或圓多角形，其直徑多在4～30 μm之間；復(fù)粒由 2～10余分淀粉粒聚合而成。可觀察到具黃色分泌物的樹脂道碎片。鑒別中可見管直徑15～55 μm，梯紋、網(wǎng)紋導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)。較少見草酸鈣簇晶，其直徑在50～80 μm之間。其中“樹脂道碎片含黃色分泌物”，經(jīng)粉碎同其他藥粉混合后被破壞，幾乎無法觀察，故在正文中未收載其顯微鑒別項。

2.1.2 紅花顯微特征顯微鑒別多可觀察到花冠、花絲、柱頭的碎片，可見直徑約66 μm的長管狀分泌細(xì)胞，其常在導(dǎo)管旁，分泌細(xì)胞含類黃棕或紅棕色的分泌物質(zhì)。可見花冠裂片頂部的表皮細(xì)胞，細(xì)胞壁外壁突起為短絨毛狀。可見柱頭和花柱上部的表皮細(xì)胞，表皮細(xì)胞分化為圓錐形的單細(xì)胞毛，其先端呈尖或稍鈍狀?；ǚ哿Ｓ?個萌發(fā)孔，外壁齒狀的突起，花粉顆粒呈現(xiàn)直徑約為60 μm的類圓形、橢圓形或橄欖形?？梢姳”诩?xì)胞中存在直徑2～6 μm的草酸鈣方狀結(jié)晶。其中“分泌細(xì)胞直徑約至66 μm，含黃棕色至紅棕色分泌物?；ǚ哿ｎ悎A形、橢圓形或橄欖形，直徑約至60 μm，具3個萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起”。特征較為明顯，且無其他干擾，在正文中收載其顯微鑒別項（圖1）。

2.1.3 龍血竭顯微特征不規(guī)則塊片血紅色，周圍液體顯鮮黃色，漸變紅色。特征較為明顯，且無其他干擾，在正文中收載其顯微鑒別項（圖1）。

2.1.4 當(dāng)歸顯微特征韌皮薄壁細(xì)胞的細(xì)胞壁略厚，呈紡錘形，可觀察到極微細(xì)的斜向交錯紋理，偶爾可見其中菲薄的橫隔。鑒別中直徑80 μm左右的梯紋導(dǎo)管及網(wǎng)紋導(dǎo)管較為多見。偶爾可觀察到油室碎片。其中“韌皮薄壁細(xì)胞紡錘形，壁略厚，表面有極微細(xì)的斜向交錯紋理，有時可見菲薄的橫隔”，經(jīng)粉碎同其他藥粉混合后被破壞，幾乎無法觀察，故在正文中未收載其顯微鑒別項。

2.1.5 乳香顯微特征《中國藥典》2010年版一部乳香項下無顯微鑒別，并且乳香無研究報道。故在正文中未收載其鑒別項。

2.1.6 延胡索顯微特征糊化淀粉粒團(tuán)塊淡黃色或近無色。下皮厚壁細(xì)胞綠黃色，細(xì)胞多角形、類方形或長條形，壁稍彎曲，木化，有的成連珠狀增厚，紋孔細(xì)密。螺紋導(dǎo)管直徑16～32 μm。該顯微特征不明顯，故在正文中未收載其顯微鑒別項。

2.1.7 茯苓顯微特征鑒別中可見不規(guī)則的顆粒狀團(tuán)塊以及分枝狀的團(tuán)塊，其無色，加入合氯醛液，可見其漸溶。菌絲呈稍彎曲狀，有分枝。多為無色或淡棕色，直徑3～8 μm，少數(shù)直徑至16 μm。其中“不規(guī)則顆粒狀團(tuán)塊和分枝狀團(tuán)塊無色，遇水合氯醛液漸溶化”特征較為明顯，且無其他干擾，在正文中收載其顯微鑒別項（圖1）。

圖1 顯微鑒別（1紅花2龍血竭3茯苓）

2.1.8 桃仁（燀桃仁）顯微特征桃仁顯微特征為種皮石細(xì)胞。桃仁經(jīng)燀制后，已經(jīng)除去種皮，燀桃仁無顯微特征，故在正文中未收載其顯微鑒別項。

2.1.9 枳殼顯微特征鑒別中可觀察到中果皮細(xì)胞。細(xì)胞呈類圓形或為不規(guī)則形狀，細(xì)胞壁大多呈現(xiàn)不均勻的增厚狀。果皮的表皮細(xì)胞，其表面觀為多角形、類方形及長方形，呈現(xiàn)直徑在 16～34 μm之間的氣孔環(huán)式，具副衛(wèi)細(xì)胞5～9個；側(cè)面觀可見外被角質(zhì)層。汁囊組織的細(xì)胞多呈皺縮狀，顏色為淡黃色或無色，并且和下層的細(xì)胞相交錯排列。在果皮和汁囊細(xì)胞中可觀察到呈斜方形、多面體形、雙錐形，直徑在3～30 μm之間的草酸鈣方狀結(jié)晶存在。螺紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管及管胞細(xì)小。其顯微特征不明顯，故在正文中未收載其顯微鑒別項。

2.2 薄層色譜

2.2.1 三七鑒別實驗①溶液的制備：供試品溶液的制備：稱取本品10 g，向其中加入甲醇50 ml，超聲預(yù)處理 60 min，對其進(jìn)行過濾，將濾液蒸干并加水40 ml溶解殘渣，以水飽和正丁醇分3次振搖提取，每次加入25 ml，最后合并正丁醇的提取溶液，使用20 ml的1%氫氧化鈉溶液進(jìn)行洗滌，洗滌2次后棄去 1%氫氧化鈉溶液。再用正丁醇飽和水溶液每次20 ml，分別洗滌2次，最終棄去水洗液，將正丁醇液蒸干，向其中加入甲醇1 ml溶殘渣，即為供試品溶液。對照品溶液的制備：分別稱取三七皂苷 R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品，加入甲醇，配制成1 mg/ml的混合對照品溶液，即為鑒別用對照品溶液。陰性對照溶液的制備：取不含三七的陰性對照品，依據(jù)供試品溶液的前處理方法進(jìn)行處理，即為鑒別用陰性對照溶液。

②方法：實驗溫度：15 ℃；相對濕度：18%；展距：8 cm；點(diǎn)樣量：上述三種溶液各5 μl；薄層板：硅膠G薄層板；展開劑：使用氯仿-醋酸乙酯-甲醇-水比例為15:40:22:10的混合溶液為展開劑，10 ℃以下放置的下層溶液；顯色：均勻噴以硫酸乙醇溶液（10%），加熱至105 ℃至斑點(diǎn)顯色清晰明顯。

③結(jié)果：供試品色譜中與對照品色譜在其相對應(yīng)的位置，呈現(xiàn)同色斑點(diǎn)；置于波長365 nm的紫外光燈下檢視，可見清晰同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性無干擾。故在正文中收載其薄層鑒別項。三批樣品按上述方法檢測，結(jié)果重現(xiàn)性良好，如圖2。

圖2 三七的薄層色譜圖

2.2.2 龍血竭鑒別實驗①溶液的制備：供試品溶液的制備：稱取供試品5g，向其中加入乙醚30 ml，進(jìn)行15 min超聲處理，進(jìn)行過濾，并對濾液進(jìn)行蒸干處理，再加入甲醇1 ml溶解殘渣，即為供試品溶液。對照藥材溶液的制備：稱取龍血竭對照藥材0.5 g，按照供試品的處理方式，制備成對照藥材溶液。陰性對照溶液的制備：取不含龍血竭的陰性對照品，按照上述供試品溶液的處理方式，制備成陰性對照溶液。

②方法：實驗溫度：15℃；相對濕度：18%；展距：8 cm；點(diǎn)樣量：上述三種溶液各10 μl；薄層板：硅膠 G；展開劑：環(huán)己烷-乙酸乙酯（5:1）；顯色：放置于波長為365 nm紫外光燈下進(jìn)行檢視。

③結(jié)果：供試品色譜與對照藥材色譜在其相對應(yīng)的位置，呈現(xiàn)相同顏色熒光斑點(diǎn)，且陰性色譜未見干擾。故在正文中收載其薄層鑒別項。三批樣品按上述方法檢測，結(jié)果重現(xiàn)性良好，如圖3。

圖3 龍血竭的薄層色譜

2.2.3 紅花鑒別實驗①溶液的制備：供試品溶液的制備：稱取1 g本品固體粉末，向其中加入10 ml丙酮溶液（80%），密封后連續(xù)振搖約20 min，經(jīng)靜置一段時間后分層，取其上層清液，即為供試品溶液。對照藥材溶液的制備：另外稱取1 g紅花對照藥材，按上述步驟制成鑒別用對照藥材溶液。陰性對照溶液的制備：取不含紅花的陰性對照，按上述步驟對陰性樣品進(jìn)行出來，即為陰性對照溶液。

②方法：實驗溫度：15℃；相對濕度：18%；展距：8 cm；點(diǎn)樣量：上述三種溶液各5 μl；薄層板：硅膠 H；展開劑：乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7:2:3:0.4）；顯色：日光下進(jìn)行檢視。

③結(jié)果：供試品色譜與對照藥材色譜相對應(yīng)的位置，沒有出現(xiàn)同樣顏色斑點(diǎn)。故在正文中未收載其薄層鑒別項。三批樣品按上述方法檢測，結(jié)果重現(xiàn)性良好，如圖4。

圖4 紅花的薄層色譜

2.2.4 延胡索鑒別實驗①溶液的制備：供試品溶液的制備：稱取5 g供試樣品，向其中加甲醇25 ml，進(jìn)行超聲預(yù)理 20 min，經(jīng)過濾后，將其濾液進(jìn)行蒸干，并加水20 ml溶解殘渣，使用濃氨試液對pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，使pH值在9～10之間。分別用30 ml乙醚對其進(jìn)行振搖提取 2次，對溶液進(jìn)行合并，使其揮干后加入甲醇1 ml溶解殘渣，即為供試品溶液。對照品溶液的制備：稱取延胡索乙素的對照品，加入甲醇配制為1 mg/ml的溶液，作為鑒別試驗對照品溶液。陰性對照溶液的制備：稱取不含延胡索的陰性對照品，依據(jù)上述供試品溶液處理步驟，配制鑒別用陰性對照溶液。

②方法：實驗溫度：15℃；相對濕度：18%；展距：8 cm；點(diǎn)樣量：上述三種溶液各5 μl；薄層板：1%氫氧化鈉溶液制備硅膠 G；展開劑：比例為環(huán)己烷-氯仿-甲醇10:4:1的混合試劑為展開劑；顯色：碘蒸氣熏至斑點(diǎn)顯色清晰，揮盡板上吸附的碘后，置于波長為365 nm紫外光燈下進(jìn)行檢視。

③結(jié)果：供試品色譜與對照品色譜，在其相對應(yīng)的位置，無熒光斑點(diǎn)。故在正文中未收載其薄層鑒別項。三批樣品按上述方法檢測，結(jié)果重現(xiàn)性良好，如圖5。

圖5 延胡索的薄層色譜

2.2.5 乳香鑒別實驗《中國藥典》2010年版一部乳香項下無薄層鑒別，并且乳香無研究報道。故在正文中未收載其鑒別項。

2.2.6 當(dāng)歸鑒別實驗①溶液的制備：供試品溶液的制備：取本品3 g，向其中加20 ml的乙醚試劑，進(jìn)行超聲預(yù)處理 10 min，對其進(jìn)行過濾，其濾液即為供試品溶液。對照藥材溶液的制備：另稱取1 g當(dāng)歸的對照藥材，向其中加20 ml乙醇試劑，超聲預(yù)處理20 min，經(jīng)過濾，濾液即為鑒別用對照藥材溶液。陰性對照溶液的制備：稱取不含乳香的陰性對照品，按照上述供試品溶液的處理方法，即可配制成鑒別用陰性對照溶液。

②方法：實驗溫度：15℃；相對濕度：18%；展距：8 cm；點(diǎn)樣量：上述三種溶液各5 μl；薄層板：硅膠 G；展開劑：正己烷-乙酸乙酯（9:1）；顯色：放置在波長為365 nm的紫外光燈下進(jìn)行檢視。

③結(jié)果：在供試品色譜與對照藥材色譜的相對應(yīng)位置，具有相同顏色熒光斑點(diǎn)，并且陰性色譜沒有干擾。故在正文中收載其薄層鑒別項。三批樣品按上述方法檢測，結(jié)果重現(xiàn)性良好，如圖6。

圖6 當(dāng)歸的薄層色譜

3 討論

正骨先行散具有活血行氣、消腫、潤腸、止痛之功效，主要用于骨折初期，在臨床中有較好的療效，但本制劑目前沒有科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制，無法保證制劑本身的質(zhì)量穩(wěn)定可控，給臨床使用也帶來了一定的用藥風(fēng)險。為有效控制其質(zhì)量，根據(jù)該品種的藥味及制法，對茯苓、三七、龍血竭等中藥成分采用顯微鑒別實驗，用薄層色譜法對三七、龍血竭、紅花等中藥成分進(jìn)行定性鑒別實驗，通過對原材料的質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制，從而保證制劑本身的質(zhì)量能滿足現(xiàn)行版藥典的相關(guān)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下要求。本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草過程中，對顯微鑒別和薄層色譜鑒別試驗中的實驗條件和檢驗方法注意事項進(jìn)行實驗摸索，并采用大量實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行充分論證。本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)通過顯微鑒別、薄層色譜分別對三七、龍血竭等中藥成分進(jìn)行鑒別，鑒別的過程進(jìn)行系統(tǒng)剖析，并對鑒別過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重點(diǎn)步驟進(jìn)行歸納和總結(jié)，從而制定訂出簡便易行，實驗結(jié)果重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)的質(zhì)量控制方法，確保正骨先行散制劑質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

本研究結(jié)果顯示，采用顯微鑒別法對正骨先行散中的茯苓、三七、龍血竭、紅花、當(dāng)歸、乳香、延胡索、桃仁進(jìn)行鑒別，其顯微鑒別特征明顯，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。采用薄層色譜法對三七、龍血竭、紅花、延胡索、當(dāng)歸進(jìn)行鑒別，試驗重復(fù)性良好，簡便易行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

正骨先行散無相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，無法達(dá)到相關(guān)監(jiān)督管理部門的要求，故對其進(jìn)行了顯微鑒別和薄層鑒別的研究，建立茯苓、三七、龍血竭、紅花、當(dāng)歸、乳香、延胡索、桃仁的顯微鑒別方法和三七、龍血竭、紅花、延胡索、當(dāng)歸的薄層鑒別方法，經(jīng)過科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒▽W(xué)研究，方法重現(xiàn)性良好，操作簡單、快捷，結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)對正骨先行散藥品內(nèi)在質(zhì)量真?zhèn)蔚目刂??？梢源_保該藥的內(nèi)在質(zhì)量，取得滿意的效果。

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10.12010/j.issn.1673-5846.2017.08.011

吉林省吉林市食品藥品檢驗所，吉林吉林 132000

楊思廣（1990.10-），本科學(xué)歷，初級藥師。研究方向：中藥