鐘 鳴 劉偉銳 楊占東 盧嘉頡 蔣兆健

高效液相色譜梯度洗脫法測定八寶驚風(fēng)散中鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量※

鐘 鳴 劉偉銳 楊占東 盧嘉頡 蔣兆健

目的采用多波長高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫法建立同時測定八寶驚風(fēng)散中鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的方法。方法采用C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流速為0.7 ml/min；以乙腈-甲醇（1:4）為流動相A，以0.1%三乙胺溶液為流動相B，梯度洗脫；檢測波長：254nm，柱溫為30℃。結(jié)果鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度分別在5.10～102.00 μg/ml（r=0.9994）、5.95～119.00 μg/ml（r=0.9996）、6.10～122.00 μg/ml（r=0.999 9）、5.65～113.00 μg/ml（r=0.9998）時與其峰面積呈良好的線性關(guān)系；鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均加樣回收率分別為97.66%、96.72%、98.99%、99.16%，RSD（n=6）分別為 1.32%、0.52%、0.78%、1.56%。結(jié)論該方法是一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法，可作為八寶驚風(fēng)散的含量控制方法。

八寶驚風(fēng)散；鉤藤堿；異鉤藤堿；升麻素苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷

在我國衛(wèi)生管理部門頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第20冊）中，八寶驚風(fēng)散主要中藥成分有鉤藤、防風(fēng)、天麻（制）、黃芩、天竺黃、全蝎（制）、沉香、丁香、冰片、茯苓、麝香、薄荷、川貝母、金礞石（煅）、膽南星、人工牛黃、珍珠、龍齒、梔子等19味，該制劑具有祛風(fēng)化痰、退熱鎮(zhèn)驚的療效，是小兒驚風(fēng)、發(fā)燒咳嗽、嘔吐痰涎等癥狀的臨床常用藥物[1-2]。八寶驚風(fēng)散處方中主藥是鉤藤和防風(fēng)，2012年衛(wèi)生管理部門頒布的標(biāo)準(zhǔn)未對該方中相關(guān)物質(zhì)含量進(jìn)行量化規(guī)定，從而對該藥的制劑工藝研究和臨床用藥產(chǎn)生一定的阻礙，為有效控制其質(zhì)量和藥效，本研究將通過高效液相色譜（HPLC）法對八寶驚風(fēng)散中主藥有效成分鉤藤所含鉤藤堿、異鉤藤堿和防風(fēng)所含升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷進(jìn)行量化研究。

1 儀器與試劑

1.1 試驗儀器1200型HPLC色譜儀采用Chemstation色譜工作站（購自美國安捷倫 Agilent科技公司）；VS-100UE型恒溫超聲波提取機(jī)（購自江蘇無錫沃信儀器有限公司）。

1.2 試驗試劑鉤藤堿對照品（批號：76-66-4，純度：98.0%）購于貴州迪大科技有限責(zé)任公司；異鉤藤堿對照品（批號：111927-201102，純度：100.0%）、升麻素苷（批號：111522-201310，純度：95.0%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號：111523-201208，純度：96.4 %）均購于中國食品藥品檢定研究院；八寶驚風(fēng)散（每瓶裝 0.26g；批號：140513、140514、140515）購于江西民濟(jì)藥業(yè)有限公司；流動相中三乙胺為分析純試劑（購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；流動相甲醇、乙腈為色譜純試劑（購自天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件本實驗色譜柱采用大龍依利特 C18柱（規(guī)格為4.6 mm×200 mm，填料粒徑為5 μm）；參照已有文獻(xiàn)和預(yù)實驗，按比例乙腈-甲醇（1:4）混合為流動相 A，0.1%三乙胺溶液為流動相 B，采用梯度洗脫方法（0～10min，65.0%A；10～22 min，65.0%→50.0%A；22～45min，50.0%A→40.0%A；45～50 min，40.0%A→65.0%A）[3-7]；檢測波長254 nm[8-10]；每分鐘流量為0.7 ml；柱溫為30℃；每次進(jìn)樣量20 μl。在此色譜條件下，所測處方中主要藥效成分與其他成分能達(dá)到較好的分離效果，按異鉤藤堿計理論塔板數(shù)≥3000，分離度≥2.0。

2.2 對照品溶液的配制依次分別稱取鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，置于4個20 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度分別為0.510 mg/ml、0.595 mg/ml、0.610 mg/ml和0.565 mg/ml對照品溶液，配制完成儲存于4℃冰箱，備用。對上述對照品母液精密吸取1.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml分別置于 50 ml容量瓶，以甲醇進(jìn)行補(bǔ)足至刻度，搖勻，即得鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷與 5-O-甲基維斯阿米醇苷質(zhì)量濃度分別為 0.0153 mg/ml、0.0119 mg/ml、0.0244 mg/ml、0.0452 mg/ml的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取八寶驚風(fēng)散適量，研細(xì)，取研細(xì)粉末10.0 g，并精密稱量，放入100 ml具塞三角錐形瓶，于電子分析天平中去皮歸零；另外精密量取50 ml甲醇加入錐形瓶，并記錄稱量值；將上述三角錐形瓶置于恒溫超聲波中（功率200 W，頻率20 kHz），超聲處理40 min；超聲結(jié)束將超聲液自然冷卻后，稱量整個三角錐形瓶重量，將缺失的甲醇進(jìn)行補(bǔ)足，并搖勻；然后，用0.45 μm針式過濾器進(jìn)行過濾，取其續(xù)濾液，即為本實驗的供試品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 陰性對照溶液的制備依據(jù)藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第20冊）中八寶驚風(fēng)散處方中藥的組成比例，分別稱取無鉤藤的所有中藥 1份和無防風(fēng)的所有中藥1份，分別按制劑工藝制備與八寶驚風(fēng)散工藝一致的鉤藤空白樣品和防風(fēng)空白樣品。制備后的空白樣品同上2.3項下的處理方法進(jìn)行配液，制成鉤藤陰性對照溶液、防風(fēng)陰性對照溶液。

2.5 專屬性實驗按 2.1項色譜條件，依次對八寶驚風(fēng)散對照品溶液、供試品溶液、鉤藤陰性對照溶液和防風(fēng)陰性對照溶液進(jìn)樣，測定相應(yīng)物質(zhì)的含量。結(jié)果：供試品溶液中吸收峰的保留時間與對照品溶液中的鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷吸收峰對應(yīng)一致，說明供試品溶液含有對應(yīng)的物質(zhì)；但鉤藤陰性對照溶液中未見鉤藤堿和異鉤藤堿色譜吸收峰；防風(fēng)陰性對照溶液譜圖中未見升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷吸收峰（圖1）。

2.6 線性關(guān)系考察取5支10 ml容量瓶分別標(biāo)號1-5號進(jìn)行標(biāo)注，另精密吸取已配制的對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml依次置于容量瓶，并用甲醇定容，搖勻。按 2.1項色譜條件進(jìn)行分析測定，根據(jù)HPLC色譜圖中相應(yīng)物質(zhì)的峰面積A及其相應(yīng)的質(zhì)量濃度 C，得鉤藤堿回歸方程為：A=2.2086×104C+267.1，r=0.9994，線性范圍為 5.10～102.00 μg/ml；異鉤藤堿A=2.0685×104C－300.7，r=0.9996，線性范圍為 5.95～119.00 μg/ml；升麻素苷 A=5.5143×104C+404.5，r=0.9999，線性范圍為 6.10～122.00 μg/ml；5-O-甲基維斯阿米醇苷 A=6.3597×104C+511.6，r=0.9998，線性范圍為 5.65～113.00 μg/ml。結(jié)果表明：鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷均有相應(yīng)的線性范圍，因此通過該方法進(jìn)行測定的對照品物質(zhì)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的HPLC

2.7 精密度試驗為考察儀器設(shè)備的精密度，精密量取2.2項中制備具的對照品溶液20 μl并按HPLC法進(jìn)樣，按2.1項中色譜條件進(jìn)行設(shè)定，通過峰面積計算各組分含量，重復(fù)上述操作共 6次，依據(jù)每次測定得到的峰面積計算4種成分鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果分別為0.83%、0.94%、0.55%和0.61%，因此該HPLC儀器設(shè)備具有良好的精密度。

2.8 重復(fù)性試驗為考察八寶驚風(fēng)散測定方法的重現(xiàn)性的優(yōu)劣，選取任意批號的八寶驚風(fēng)散，稱取該批號藥品6份作為供試品，按2.3項處理方法進(jìn)行配制，按2.1項色譜條件進(jìn)行設(shè)定，依據(jù)每份供試品測定的峰面積計算 4種成分鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果分別為0.82%、0.64%、0.57%和0.42%，因此該測定方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.9 穩(wěn)定性試驗為考察八寶驚風(fēng)散供試品溶液的穩(wěn)定性，選取任意批號的八寶驚風(fēng)散，稱取該批號藥品1份作為供試品，按2.3項處理方法進(jìn)行配制，配制后的溶液放置于室溫條件中，分別在0、2、4、8、12、24 h時精密量取20 μl，按2.1項方法進(jìn)行測定，依據(jù)不同時點測定的峰面積計算 4種成分鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果分別為 0.76%、0.88%、0.51%和0.49%，因此24 h內(nèi)八寶驚風(fēng)散供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。

2.10 加樣回收率試驗稱取已知各主要成分含量的八寶驚風(fēng)散（鉤藤堿為 0.079 mg/g、異鉤藤堿為0.063 mg/g、升麻素苷為0.121 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇苷為0.218 mg/g）適量，研細(xì)，精密稱取研細(xì)粉末5.0 g，放入100 ml具塞三角錐形瓶，于電子分析天平中去皮歸零；另外精密量取25 ml甲醇和25 ml已制備的對照品溶液加入該錐形瓶，并記錄稱量值；將上述三角錐形瓶放入恒溫超聲波中（功率200 W，頻率20 kHz），超聲處理40 min；超聲結(jié)束后將超聲液自然冷卻后，稱量整個三角錐形瓶重量，將缺失的甲醇補(bǔ)足，搖勻；然后，用0.45 μm針式過濾器進(jìn)行過濾，取其續(xù)濾液，作為本實驗的加樣供試品試液，儲存?zhèn)溆?。測定的色譜條件按2.1項方法進(jìn)行設(shè)定，依據(jù)測定的峰面積計算各組分回收率，結(jié)果見表1。

2.11 樣品測定選取不同批號的八寶驚風(fēng)散3份作為待測樣品，按2.3項方法進(jìn)行待測溶液的配制，精密吸取待測樣品溶液20 μl并按HPLC方法進(jìn)樣，按2.1項色譜條件進(jìn)行設(shè)定，通過峰面積計算鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷組分含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 供試品制備提取時間的選擇，在試驗過程中分別對供試品制備時的超聲提取時間進(jìn)行了對比研究，在超聲波（功率200 W，頻率20 kHz）條件下分別超聲處理20 min、40 min和60 min，對不同超聲時間進(jìn)行考察。各時點超聲結(jié)果顯示，八寶驚風(fēng)散各主要成分含量由高到底依次為60 min、40 min和20 min，且20 min含量明顯低于超聲提取40 min和60 min的含量，而超聲提取40 min與60 min含量差異不大，因此本測定方法采用超聲波（功率200 W，頻率20 kHz）條件下超聲提取40 min作為八寶驚風(fēng)散供試品溶液的提取方法。

表1 鉤藤堿、異鉤藤堿、升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷回收率試驗

表2 樣品含量測定結(jié)果(±s,n=3)

表2 樣品含量測定結(jié)果(±s,n=3)

批號 鉤藤堿(mg/g)異鉤藤堿(mg/g)升麻素苷(mg/g)5-O-甲基維斯阿米醇苷(mg/g)140513 0.079±0.001 0.063±0.001 0.121±0.001 0.218±0.002 140514 0.085±0.001 0.067±0.001 0.108±0.001 0.211±0.001 140515 0.081±0.001 0.061±0.001 0.127±0.001 0.227±0.002

3.2 本實驗還考察了不同流動相的梯度洗脫方法（甲醇-水、甲醇-0.1%三乙胺溶液、乙腈-0.1%三乙胺溶液、乙腈-甲醇（1:4）與 0.1%三乙胺溶液）對測定八寶驚風(fēng)散各主要成分含量的影響，結(jié)果以乙腈-甲醇（1:4）與 0.1%三乙胺溶液不同比例梯度洗脫分離度效果最佳，峰型對稱，各峰之間無重疊，故選取乙腈-甲醇（1:4）與 0.1%三乙胺溶液作為流動相梯度洗脫。

3.3 鉤藤為茜草科植物鉤藤、大葉鉤藤、毛鉤藤、華鉤藤或無柄果鉤藤的干燥帶鉤莖枝，具有息風(fēng)定驚、清熱平肝的功效，可用于肝風(fēng)內(nèi)動、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇、頭痛眩暈等癥的治療；中藥防風(fēng)具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效，可用于感冒頭痛、風(fēng)濕痹痛、風(fēng)疹瘙癢、破傷風(fēng)等癥的治療。鉤藤堿和異鉤藤堿為鉤藤的主要成分，升麻素苷和 5-O-甲基維斯阿米醇苷為防風(fēng)的主要成分，通過本研究的 HPLC測定方法，能快速、靈敏、準(zhǔn)確測定八寶驚風(fēng)散中的 4個主要成分，為八寶驚風(fēng)散產(chǎn)品質(zhì)量控制和量化臨床用藥提供可靠的方法。

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Determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San by HPLC

Zhong Ming Liu Weirui Yang Zhandong Lu Jiajie Jiang Zhaojian

ObjectiveTo develop an HPLC method for the simultaneous determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline, Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San.MethodsThe chromatograhic separation was performed on C18column(4.6 mm×200 mm,5 μm),A linear elution of acetonitrilemethanol(1:4) and 0.1% triethylamine solution was adopted at the flow rate of 0.7 ml/min.The detection wavelength were 254 nm.The column temperature was 30℃.ResultsRhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside had good linearity at 5.10～102.00 μg/ml(r=0.9994)、5.95～119.00 μg/ml(r=0.9996)、6.10～122.00 μg/ml(r=0.9999)、5.65～113.00 μg/ml(r=0.9998),respectively.The average recoveries and RSD were 97.66%(1.32%),96.72%(0.52%), 98.99%(0.78%) and 99.16%(1.56%),respectively.Conclusion The method was simple,convenience and may be used in the determination of Rhyncholphylline,Isorhynchophylline,Prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-Methylvisammioside in Babao Jingfeng San.

Babao Jingfeng San;Rhyncholphylline;Isorhynchophylline;Prim-O-glucosylcimifugin;5-O-Methylvisammioside

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.08.010

廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510240

國家發(fā)展和改革委員會2011年國家工程研究中心創(chuàng)新能力建設(shè)項目（編號：發(fā)改辦高技[2011]1896號）

鐘鳴（1973.2-），碩士，制藥高級工程師。主要從事中藥/天然藥物的研究與開發(fā)工作。Email：gzmingzhong@126.com

蔣兆健（1968.3-），博士，主任藥師。主要從事新藥的研究與開發(fā)工作。Email：jzj100508@163.com