盧華君，趙忠艷，林小春，方玲娟，閆秀梅，黃開宇

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院兒童消化科，浙江 溫州 325027)

克羅恩病患兒血清細(xì)胞因子水平的研究

盧華君，趙忠艷，林小春，方玲娟，閆秀梅，黃開宇

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 育英兒童醫(yī)院兒童消化科，浙江 溫州 325027)

目的 通過研究克羅恩病(CD)患兒血清細(xì)胞因子水平，探討其在兒童CD發(fā)病與發(fā)展中的作用。方法 采用流式微球分析技術(shù)，檢測2013年1月至2015年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院的32例CD患兒和30名正常對(duì)照兒童的血清白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ、IL-17A水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 CD患兒血清中的IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α、IL-17A水平均顯著高于正常對(duì)照組(t值分別為2.822、2.643、5.713、2.962、3.183，均P<0.05)；而血清中的IL-10、IFN-γ水平則顯著低于正常對(duì)照組(t值分別為2.554、2.634，均P<0.05)。此外，兒童CD活動(dòng)指數(shù)(PCDAI)評(píng)分為中重度的患兒血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平顯著高于評(píng)分為輕度的患兒(t值分別為2.233、2.332、2.531，均P<0.05)；而血清IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平的PCDAI評(píng)分則中重度活動(dòng)與輕度活動(dòng)CD患兒差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論 與正常兒童相比，CD患兒存在明顯細(xì)胞因子水平變化，而且疾病活動(dòng)度不同其細(xì)胞因子水平亦有差異，提示細(xì)胞因子水平紊亂在兒童CD發(fā)病及病情的發(fā)展中有重要作用。

克羅恩?。患?xì)胞因子；流式細(xì)胞術(shù)；兒童

克羅恩病(Crohn’s disease，CD)是一種非特異性的消化道炎癥性疾病，病變可累及消化道的各個(gè)部位，特別是末段回腸和結(jié)腸，也可累及全身各個(gè)系統(tǒng)。該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制也不完全清楚。既往研究支持CD是一種腸道免疫平衡失調(diào)的表現(xiàn)，涉及多種炎癥細(xì)胞與炎癥介質(zhì)的作用。兒童CD為早期發(fā)病亞型，與成人CD相比，對(duì)兒童CD研究相對(duì)滯后。因此，研究CD患兒的免疫應(yīng)答變化有助于闡明兒童CD的致病機(jī)理，對(duì)于指導(dǎo)對(duì)CD患兒的治療有重要意義。本研究擬通過檢測CD患兒血清中白介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ等細(xì)胞因子水平，分析其與兒童CD的關(guān)系，探討兒童CD的發(fā)病機(jī)制及個(gè)體的免疫應(yīng)答情況。

1對(duì)象和方法

1.1研究對(duì)象及分組

病例組為2013年1月至2015年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒童內(nèi)科住院的CD患兒32例，其中男18例，女14例，年齡7～15(8.5±4.3)歲。所有病例經(jīng)過胃腸鏡、影像學(xué)和組織病理學(xué)檢查，結(jié)合臨床表現(xiàn)確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[1]。病例采用兒童CD活動(dòng)指數(shù)(PCDAI)對(duì)患兒疾病活動(dòng)度進(jìn)行評(píng)分，0～10分為不活動(dòng)，11～30分為輕度活動(dòng)，≥31分為中/重度活動(dòng)。32例CD患兒包括輕度活動(dòng)12例，中重度活動(dòng)20例，無不活動(dòng)患兒。正常對(duì)照組為30名同期在本院門診體檢的健康兒童，其中男18例，女12例，年齡6～13(10±3.5)歲。兩組年齡、性別比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。病例組和對(duì)照組所有兒童均晨起空腹用干燥試管采集靜脈血2mL用于細(xì)胞因子水平檢測。

1.2細(xì)胞因子的檢測

干燥試管采集的靜脈血靜置后離心取得血清，用EP管分裝，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用流式微球分?cytometric bead assay，CBA)技術(shù)檢測血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A這7種細(xì)胞因子水平。細(xì)胞因子檢測試劑盒由BD公司提供。檢測方法參考有關(guān)文獻(xiàn)[2]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組兒童血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10的檢測結(jié)果

病例組患兒血清IL-2、IL-4和IL-6水平明顯高于對(duì)照組，而血清IL-10水平則明顯低于對(duì)照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組兒童血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10水平的比較結(jié)果

2.2兩組兒童血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A的檢測結(jié)果

病例組患兒血清中TNF-α、IL-17A水平明顯高于對(duì)照組，而IFN-γ水平則明顯低于對(duì)照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

2.3中重度活動(dòng)與輕度活動(dòng)克羅恩病患兒血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平的比較

血清IL-2水平在中重度活動(dòng)組顯著高于輕度活動(dòng)組(P<0.05)，而兩組患兒血清中IL-4、IL-6和IL-10水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。

表2 兩組兒童血清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A水平的比較結(jié)果

表3 不同活動(dòng)度CD患兒血清中IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平的比較結(jié)果

2.4中重度活動(dòng)與輕度活動(dòng)克羅恩病患兒血清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平的比較

中重度活動(dòng)患兒血清TNF-α和IL-17A水平均顯著高于輕度活動(dòng)患兒(均P<0.05)，而兩組患兒血清IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同活動(dòng)度CD患兒血清中TNF-α、IFN-γ和IL-17A水平的比較結(jié)果

3討論

3.1兒童克羅恩病的臨床特征

兒童CD是一種發(fā)生于兒童時(shí)期的非特異性的消化道慢性炎癥性疾病。目前國內(nèi)兒童CD發(fā)病率尚無確切報(bào)道，國外資料顯示兒童CD的發(fā)病率為5/10萬～6.6/10萬，且呈逐漸上升趨勢[3-4]。由于兒童CD臨床表現(xiàn)不典型且缺乏特異性實(shí)驗(yàn)室檢查，診斷比較困難。兒童CD的診斷需要根據(jù)臨床表現(xiàn)并結(jié)合輔助檢查綜合判斷。兒童CD臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、血便，其中腹痛最常見[5]。部分病例可表現(xiàn)為腸套疊、腸梗阻；部分患兒在病程中可出現(xiàn)發(fā)熱。此外，兒童CD往往存在消瘦、貧血、低蛋白血癥等營養(yǎng)不良表現(xiàn)。針對(duì)兒童CD的主要輔助檢查手段包括影像學(xué)檢查、消化內(nèi)鏡檢查、組織病理學(xué)檢查等。腹部B超能監(jiān)測腸壁的血供及動(dòng)力狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)腸壁的不均勻性、階段性增厚情況，可作為兒童CD診斷時(shí)的有效線索。消化內(nèi)鏡檢查是診斷兒童CD的必要手段，內(nèi)鏡下兒童CD病變主要表現(xiàn)為黏膜破壞和慢性增生同時(shí)存在，典型病例能見到縱行裂隙狀潰瘍及鋪路石樣改變，但在早期病變不典型的情況下，易與腸結(jié)核、潰瘍性結(jié)腸炎、腸道腫瘤等疾病相混淆。兒童CD的組織病理學(xué)改變無特異性，以黏膜的慢性非特異性炎癥改變?yōu)橹鳎袝r(shí)可見干酪性肉芽腫。因此病理學(xué)表現(xiàn)在疾病診斷早期僅能作為參考條件。血常規(guī)、血沉及C-反應(yīng)蛋白、血漿白蛋白在疾病活動(dòng)期均有不同程度的改變，可作為監(jiān)測疾病活動(dòng)情況的有效指標(biāo)[6]。

3.2兒童克羅恩病的發(fā)病機(jī)制

兒童CD的發(fā)病機(jī)制目前不清楚，其病因?qū)W一直是研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為CD的發(fā)病與遺傳、環(huán)境、感染和免疫等多種因素相互作用有關(guān)，屬于自身免疫性疾病的一種，免疫調(diào)節(jié)紊亂是其發(fā)病的關(guān)鍵因素。腸道的免疫平衡是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫性T細(xì)胞調(diào)控，免疫性T細(xì)胞可以分為輔助性T細(xì)胞(Th)以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞。如果免疫性T細(xì)胞過度增生、免疫原性增強(qiáng)，或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量減少、功能異常，均可打破兩者平衡，從而誘發(fā)CD，導(dǎo)致腸黏膜損傷。在CD的免疫應(yīng)答中，Th是主要的參與者。Th在不同細(xì)胞因子的刺激下，可以分為Th1、Th2。Th1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α等；Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-10等。目前認(rèn)為CD的發(fā)病是以Th1介導(dǎo)為主，其中TNF-α已引起廣泛注意。有研究表明，TNF-α是CD發(fā)病中一個(gè)重要的促炎因子[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，去除小鼠T細(xì)胞TNF-α基因的3'非翻譯區(qū)會(huì)導(dǎo)致TNF-α水平升高并產(chǎn)生CD樣的表型，形成節(jié)段性累及腸壁全層的肉芽腫性腸炎[7]。本研究中CD患兒血清IFN-γ和IL-10明顯低于正常對(duì)照組，而IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α和IL-17A水平則明顯高于對(duì)照組。IFN-γ是最典型的Th1型細(xì)胞因子，具有抗炎癥活性，其降低可能導(dǎo)致機(jī)體抵抗炎癥反應(yīng)的能力降低。與正常對(duì)照組兒童相比，CD患兒血清IL-10濃度降低，提示可能由于存在某種因素抑制了IL-10的產(chǎn)生，導(dǎo)致不能削弱機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡。由于IL-4的異常升高可刺激B細(xì)胞分泌IgE，而IFN-γ是一個(gè)IgE合成的潛在抑制物，那么IL-4與IFN-γ的失衡就可能使患兒IgE水平增高，從而引起了一系列腸黏膜炎癥改變。CD患兒血清IL-2水平的升高，可能與多種細(xì)胞因子水平的變化并相互誘生有關(guān)。CD患兒巨噬細(xì)胞合成并分泌大量TNF-α，直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，加重了消化道組織的損傷。而消化道組織的損傷又促使TNF-α因子的釋放，形成惡性循環(huán)，造成消化道炎癥反應(yīng)的反復(fù)發(fā)生和遷延不愈。Th17細(xì)胞是一群新近鑒定的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，該細(xì)胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-23等細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的促炎癥作用，其中最主要的是IL-17A，其與Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞一起廣泛參與了機(jī)體的免疫防御及免疫調(diào)節(jié)過程。IL-17可能通過激活細(xì)胞因子、趨化因子，增加TNF-α誘導(dǎo)的消化道平滑肌細(xì)胞的IL-6表達(dá)，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的成熟和激活。Strober等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在CD患者腸道炎癥黏膜中，Th1相關(guān)的細(xì)胞因子(如TNF-α、IFN-γ)和Th17相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-17A)顯著升高，與本研究CD患兒血清細(xì)胞因子變化相類似。本研究還發(fā)現(xiàn)，中重度活動(dòng)CD患兒血清TNF-α、IL-2和IL-17A水平顯著高于輕度活動(dòng)CD患兒，而IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-10水平則均無顯著性差異，提示TNF-α、IL-2和IL-17A在兒童CD疾病發(fā)展及活動(dòng)中可能起重要作用。

3.3兒童克羅恩病的治療

兒童CD的治療目前尚無統(tǒng)一且絕對(duì)有效的方案。除了一般營養(yǎng)治療外，糖皮質(zhì)激素、5氨基水楊酸(5-ASA)、6-巰基嘌呤、柳氮磺吡啶、美沙拉秦、沙利度胺等均可用于兒童CD的治療。有研究者認(rèn)為，CD患兒在患病早期應(yīng)用抗TNF-α制劑治療的效果優(yōu)于一般免疫治療[7]。英夫利西(infliximab，IFX)為抗TNF-α單克隆抗體，可通過與巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞表面表達(dá)的TNF-α高親和力結(jié)合而拮抗TNF-α的生物活性。通過抗體依賴性細(xì)胞毒作用、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用及影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終加速細(xì)胞周期阻滯、凋亡及抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生[9]。

本研究結(jié)果提示，與健康兒童相比，CD患兒存在血清細(xì)胞因子水平的紊亂，而且疾病活動(dòng)度不同其細(xì)胞因子水平亦有差異，提示細(xì)胞因子水平紊亂在兒童CD發(fā)病及病情的發(fā)展中有重要作用。如果能深入探討CD患兒的免疫應(yīng)答變化，將有助于闡明兒童CD的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)行個(gè)體化免疫干預(yù)治療。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)消化學(xué)組兒童炎癥性腸病協(xié)作組.兒童炎癥性腸病診斷規(guī)范共識(shí)意見[J].中國實(shí)用兒科雜志,2010,25(4):263-265.

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[專業(yè)責(zé)任編輯：肖延風(fēng)]

Serum cytokine level in children with Crohn’s disease

LU Hua-jun, ZHAO Zhong-yan, LIN Xiao-chun, FANG Ling-juan, YAN Xiu-mei, HUANG Kai-yu

(DepartmentofPediatricGastroenterology,SecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospitalofWenzhouMedicalUniversity,ZhejiangWenzhou325027,China)

Objective To explore the serum cytokine level in children with Crohn’s disease (CD) and to investigate its relationship with incidence and development of CD in children. Methods Serum interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ and IL-17A levels in 32 children with CD hospitalized in Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University from January 2013 to December 2015 and in 30 healthy children were detected using flow cytometry and test results were analyzed statistically. Results Serum levels of IL-2, IL-4, IL-6, TNF-α and IL-17A in children with CD were significantly higher than those in healthy controls (tvalue was 2.822, 2.643, 5.713, 2.962 and 3.183, respectively, allP<0.05), while serum levels of IL-10 and IFN-γ in CD children were much lower than those in healthy controls (tvalue was 2.554 and 2.634, respectively, bothP<0.05). In addition, serum levels of TNF-α, IL-2 and IL-17A in moderate and severe cases identified by pediatric Crohn’s disease activity index (PCDAI) were significantly higher than in mild cases (tvalue was 2.233, 2.332 and 2.531, respectively, allP<0.05). But serum levels of IFN-γ, IL-4, IL-6 and IL-10 in moderate and severe cases identified by PCDAI had no significant difference compared to those in mild cases (allP>0.05). Conclusion Compared to healthy children, serum cytokine levels in children with CD change significantly, and cytokine levels are different in cases at different degree of disease activity, indicating that cytokine level disorder may play an important role in incidence and development of pediatric CD.

Crohn’s disease(CD); cytokine; flow cytometry ; children

2016-11-10

溫州市科技局資助項(xiàng)目(Y20120085)

盧華君(1977—)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事兒童消化道疾病的研究。

黃開宇，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.007

R725.7

A

1673-5293(2017)08-0913-03