魯 波，包 磊，李美平，沈 寅，任麗芳，張 鵬

(紹興市婦幼保健院，浙江 紹興 312000)

HC2聯(lián)合細(xì)胞塊P16技術(shù)在液基細(xì)胞診斷中的應(yīng)用

魯 波，包 磊，李美平，沈 寅，任麗芳，張 鵬

(紹興市婦幼保健院，浙江 紹興 312000)

目的 探討細(xì)胞塊免疫組化p16染色聯(lián)合二代雜交捕獲技術(shù)檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒在宮頸液基細(xì)胞學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2015年1月至2016年11月在紹興市婦幼保健院宮頸液基細(xì)胞學(xué)初檢判讀為上皮內(nèi)病變細(xì)胞(NILM)后，取TCT剩余保存液制細(xì)胞塊行免疫組化p16染色，同時(shí)行二代雜交捕獲檢測(cè)的患者156例。結(jié)果 156例宮頸TCT初檢判讀為NILM的患者，HC2檢測(cè)均為陽(yáng)性；運(yùn)用細(xì)胞塊免疫組化P16檢測(cè)并復(fù)查T(mén)CT，宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的檢出率為19.23%(30/156)。結(jié)論 TCT聯(lián)合運(yùn)用HC2和細(xì)胞塊P16技術(shù)可以有效地提高宮頸癌及癌前病變篩查的準(zhǔn)確性，減少漏診率。

細(xì)胞塊；p16蛋白；液基細(xì)胞學(xué)；第二代雜交捕獲技術(shù)

宮頸癌是一種發(fā)病率僅次于乳腺癌的婦科第二大惡性腫瘤，近年來(lái)在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)且年齡越來(lái)越年輕化[1]。得益于液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)的推廣，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降，但由于受到標(biāo)本現(xiàn)狀、制片水平、閱片經(jīng)驗(yàn)的限制，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytologic test，TCT)會(huì)存在一定的漏診率，因此需更加客觀的輔助方法幫助其提高敏感性和特異性[2]。本文通過(guò)第二代雜交捕獲技術(shù)(hybrid capture Ⅱ，HC2)聯(lián)合細(xì)胞塊P16進(jìn)行免疫組化技術(shù)取得了較好的效果，現(xiàn)介紹如下。

1材料與方法

1.1材料

收集2015年1月至2016年11月紹興市婦幼保健院行宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查診斷為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM)，HC2陽(yáng)性共計(jì)156例。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞學(xué)檢查

宮頸液基細(xì)胞學(xué)采用美國(guó)Cytic公司的Thingpath 2000技術(shù)，巴氏染色。細(xì)胞學(xué)診斷以宮頸/陰道細(xì)胞學(xué)診斷報(bào)告方式(the bethesda system，TBS)(2001)診斷報(bào)告模式為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2細(xì)胞塊制備

將TCT殘液倒入10mL玻璃試管，以2 000r/min離心5min后棄上清液，加入2～3mL自制瓊脂后放入離心機(jī)中，以1 500r/min離心15min靜置后,用回形針輕輕刮動(dòng)細(xì)胞快使其脫離管壁，用紗布包裹，放入10%中性福爾馬林固定后入脫水機(jī)處理，常規(guī)包埋，切片，蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。

1.2.3第二代雜交捕獲技術(shù)法

利用對(duì)抗體捕獲信號(hào)的放大和化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測(cè)，一次性檢測(cè)13種高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)型別。步驟如下：①堿性溶液破壞病毒DNA，雙鏈被釋放并分解為核苷酸單鏈；②DNA單鏈與RNA探針結(jié)合為RNA-DNA雜交復(fù)合物；③第一抗體(特異性抗體)將RNA-DNA雜交復(fù)合物固定在微孔壁上；④結(jié)合有堿性磷酸酶的多個(gè)第二抗體與RNA-DNA雜交復(fù)合物結(jié)合使信號(hào)放大；⑤堿性磷酸酶使酶底物發(fā)光，判讀光的強(qiáng)弱可確定堿性磷酸酶的含量從而確定RNA-DNA的含量：⑥ 結(jié)果判定：HPV DNA≥1.0pg/mL即判定為陽(yáng)性。

1.2.4免疫組化P16法

P16抗體及EnVision試劑盒均采自基因有限公司，免疫組化操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)以上皮細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>5個(gè)為陽(yáng)性。

2結(jié)果

在156例TCT初步診斷為NILM，最后通過(guò)細(xì)胞塊P16聯(lián)合HC2結(jié)果，復(fù)查T(mén)CT發(fā)現(xiàn)不除外高度病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H)，高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)檢出率為19.23%(30/156)，見(jiàn)圖1、圖2和表1。

注：細(xì)胞量少，標(biāo)本滿(mǎn)意度低，鏡下無(wú)法顯示異型細(xì)胞。

注：制作成細(xì)胞塊后HE染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞量多，聚縮成團(tuán)，可見(jiàn)異型鱗狀細(xì)胞。

表1 HC2聯(lián)合細(xì)胞塊P16檢測(cè)初檢TCT為NILM病例結(jié)果[n(%)]

3討論

3.1 TCT檢查優(yōu)缺點(diǎn)及細(xì)胞塊技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)

TCT檢查是目前國(guó)際上較先進(jìn)的一種宮頸癌細(xì)胞學(xué)檢查技術(shù)，與傳統(tǒng)的宮頸刮片巴氏涂片檢查相比明顯提高了標(biāo)本的滿(mǎn)意度及宮頸異常細(xì)胞檢出率。然而有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞學(xué)診斷與組織學(xué)診斷總符合率僅為60%～70%[3]，如何增加診斷的準(zhǔn)確率減少漏診率是令人關(guān)注的問(wèn)題，TCT篩查中，部分標(biāo)本黏液，血液多和上皮細(xì)胞少等缺點(diǎn)在制片過(guò)程中始終存在(見(jiàn)圖1)，而細(xì)胞塊技術(shù)能很好的解決這一系列的問(wèn)題，細(xì)胞塊采集細(xì)胞多，它能使細(xì)胞聚縮成團(tuán)，細(xì)胞的組織碎片經(jīng)高度濃縮后形成組織學(xué)模式，細(xì)胞分布適中，不會(huì)出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)HE染色后結(jié)構(gòu)更為清晰，更易發(fā)現(xiàn)異型細(xì)胞，因此在一定程度上彌補(bǔ)了細(xì)胞學(xué)診斷的局限性(見(jiàn)圖2)。而且細(xì)胞塊制片背景干凈，對(duì)陽(yáng)性胞質(zhì)、胞核、胞膜均易識(shí)別，更清晰見(jiàn)到組織碎片，可以幫助判斷宮頸病變的嚴(yán)重程度。

3.2 HC2在宮頸癌及癌前病變篩查中的優(yōu)勢(shì)

眾所周知，HPV持續(xù)感染是子宮頸癌和癌前病變發(fā)生的主要因素，它通過(guò)兩個(gè)致癌蛋白E6，E7結(jié)合多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，使DNA受損的細(xì)胞發(fā)生異常增殖，導(dǎo)致腫瘤形成。HC2是經(jīng)過(guò)美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(U.S. Food and Drug Administration,FDA)，歐洲CE(Conformite Europeenne，CE)和中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(State Food and Drug Administration，SFDA)共同認(rèn)證的檢測(cè)技術(shù)[4]。其檢測(cè)靈敏度高，特異性好，重復(fù)性和客觀性強(qiáng)等特點(diǎn)，能有效的檢測(cè)出13種高危型病毒，已經(jīng)成為宮頸癌病因?qū)W篩查方法并已廣泛使用。但其方法是HPV檢測(cè)，是病因?qū)W檢測(cè)，主要反映患者當(dāng)前是否感染HPV，并不能實(shí)際反映病毒的致癌能力。最近研究也發(fā)現(xiàn)，高危型HPV的病毒負(fù)荷量增高與宮頸病變的嚴(yán)重程度的增加相關(guān)，但與宮頸癌的預(yù)后關(guān)系目前尚無(wú)定論[5]。

3.3 P16蛋白在子宮頸癌及癌前病變中的表達(dá)

P16基因蛋白通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白D競(jìng)爭(zhēng)，特異性結(jié)合CDK4/6并抑制其活性組織細(xì)胞進(jìn)入G/S期，負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分裂，從而達(dá)到抑癌作用。HPV持續(xù)感染狀態(tài)是Rb基因與其致癌蛋白E7結(jié)合后失活，破壞P16的負(fù)反饋，導(dǎo)致P16過(guò)表達(dá)[6]，細(xì)胞將持續(xù)增殖形成腫瘤。Juric等[7]研究表明，P16表達(dá)與子宮頸癌及癌前病變的發(fā)生起著重要作用。國(guó)外已有學(xué)者將P16免疫組織化學(xué)染色成功得應(yīng)用于宮頸細(xì)胞學(xué)[8]，認(rèn)為其診斷高級(jí)別宮頸癌前病變的敏感性和特異性都較高。但從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明，幾例細(xì)胞塊切片上也同樣未見(jiàn)異型細(xì)胞，分析原因可能是細(xì)胞本身數(shù)量少或者細(xì)胞塊面積有限，該切片剛好未包含異型細(xì)胞，對(duì)此情況要采取多人會(huì)診討論，以提高準(zhǔn)確性。

因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，HC2和細(xì)胞塊P16技術(shù)兩種方法聯(lián)合運(yùn)用有效地提高了宮頸癌及癌前病變篩查的敏感性和準(zhǔn)確性，減少漏診率，能較早的發(fā)現(xiàn)高危人群，做到早發(fā)現(xiàn)，早治療，減少早期宮頸癌及癌前病變的發(fā)生發(fā)展。

[1]孔建平,羅柳珍.薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)宮頸病變的診斷價(jià)值[J].中國(guó)婦幼健康研究,2013,24(3):366-368

[2]吳共發(fā),鄭娜芬,葉梓瑩,曾宇婷,等.細(xì)胞塊在宮頸液基細(xì)胞學(xué)疑難病例中的應(yīng)用價(jià)值[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(23):3823-3825

[3]蘇學(xué)英,陳志強(qiáng).細(xì)胞穿刺診斷中應(yīng)用細(xì)胞塊的價(jià)值分析[J].中華病理學(xué)雜志,2003,32(1):55-56

[4]戈文舜,任麗芳,李美平,蔡紅光,等.細(xì)胞塊P16聯(lián)合高危型HPV檢測(cè)在ASCUS患者分流管理中的作用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(8):868-870

[5]張宏,王毅,張守波,丁亞麗.P16蛋白及二代雜交捕獲法檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒在宮頸病變?cè)\斷中聯(lián)合運(yùn)用分析[J].山西醫(yī)藥雜志,2015,44(22):2644-2645

[6]廖光東,郄明蓉．p16ink4蛋白在子宮頸上皮內(nèi)瘤變?cè)\斷和轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]．中華婦產(chǎn)科雜志,2013,48(11):875-6．

[7]Juric D, Mahovlie V, Rajhvajn S,etal. Liquid-based cytology-new possibilities in the diagnosis of cervical lesions[J]. CoilAntropol, 2010, 34(1):19-24.

[8]Tabrizi S N,Tan S E,von Knebel Doeberitz C,etal.Evalua-tion of P16INK4a immunostaining for the detection of high-g rade changes in cervical cytology[J].Pathology,2015,47(4):314-319.

[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：張冠軍]

Application of HC2 combining P16 of cell block in liquid-based cytology diagnosis

LU Bo, BAO Lei, LI Mei-ping, SHEN Yin, REN Li-fang, ZHANG Peng

(ShaoxingMaternityandChildHealthHospital,ZhejiangShaoxing312000,China)

Objective To explore the value of immunocytochemistry P16 of cell block combining hybrid capture Ⅱ (HC2) in testing high-risk HPV in cervical liquid-based cytology. Methods Totally 156 cases whose initial cervical cytology interpretation as negative for intraepithelial lesion or malignancy (NILM) were selected. The remains of liquid of TCT were used to make cell block for immunocytochemistrically P16 test. And the cases accepted HC2. Results HC2 were all positive in 156 patients with cervical cytology interpretation as NILM. Detection rate of high-grade squamous intraepithelial lesion was 19.23% (30/156) by immunocytochemistry P16 of cell block and TCT again. Conclusion TCT together with HC2 and immunocytochemistry P16 of liquid-based cytology cell block can effectively enhance the accuracy of cervical cancer and precancerous lesions screening and reduce missed diagnosis rate.

cell block; protein P16; liquid-based cytology; hybrid capture Ⅱ(HC2)

2017-01-13

魯 波(1983—)，男，主管技師，主要從事病理技術(shù)工作。

包 磊，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.08.046

R711.7

A

1673-5293(2017)08-1023-02