文 亮

石西南2 SHI Xi'nan

何利平3 HE Liping

魯 毅1 LU Yi

韓 丹1 HAN Dan

錳濃度對不同結(jié)腸癌細(xì)胞株錳增強(qiáng)磁共振成像效果的影響

文 亮1WEN Liang

石西南2SHI Xi'nan

何利平3HE Liping

魯 毅1LU Yi

韓 丹1HAN Dan

目的錳濃度是影響腫瘤錳增強(qiáng)磁共振成像（MEMRI）效果的最基本因素，本文研究其對不同結(jié)腸癌細(xì)胞株MEMRI效果的影響。材料與方法在0、0.05、0.10、0.20 mmol/L錳濃度下分別對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620（高轉(zhuǎn)移潛能）、SW480（低轉(zhuǎn)移潛能）與正常細(xì)胞株CCD841 CoN進(jìn)行體外MEMRI檢測。T1 map計(jì)算細(xì)胞株在不同錳濃度下的平均T1縮短值。結(jié)果錳濃度為0.10、0.20 mmol/L時(shí)，3種細(xì)胞株平均T1縮短值大小依次為SW620＞SW480＞CCD841 CoN，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常細(xì)胞株在不同錳濃度（0.05、0.10、0.20 mmol/L）下平均T1縮短值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩種瘤細(xì)胞平均T1縮短值隨錳濃度升高而升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在較高錳濃度（0.10、0.20 mmol/L）條件下，SW620較SW480攝錳更多。結(jié)論結(jié)腸癌細(xì)胞體外攝錳程度隨錳濃度升高而增加，MEMRI可區(qū)分具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞株。

結(jié)直腸腫瘤；磁共振成像；圖像增強(qiáng)；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；錳

結(jié)腸癌是常見且死亡率較高的惡性腫瘤之一[1]。MRI已越來越多地應(yīng)用于結(jié)直腸癌的診斷與分期[2-4]，但常規(guī)MRI主要基于形態(tài)學(xué)改變診斷腫瘤，仍存在諸多局限。錳增強(qiáng)磁共振成像（manganese-enhanced magnetic resonance imaging，MEMRI）是采用細(xì)胞內(nèi)特異性造影劑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像的技術(shù)，其在檢出惡性腫瘤、發(fā)現(xiàn)早期小瘤灶以及判斷腫瘤的惡性程度等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值[5-12]，但尚未見結(jié)腸癌相關(guān)的研究報(bào)道。為深入分析腫瘤MEMRI的影像表現(xiàn)、探討其在結(jié)腸癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值，本研究擬以不同結(jié)腸癌細(xì)胞株為研究對象，探討錳劑濃度對結(jié)腸癌細(xì)胞MEMRI增強(qiáng)效果的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 采用臺盼藍(lán)拒染法檢測對數(shù)生長期細(xì)胞在0.20 mmol/L錳濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 min后的活性。光鏡下觀察細(xì)胞染色情況，根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480購自ATCC；正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞株CCD841 CoN購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。SW620、SW480細(xì)胞株分別來源于同一患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和結(jié)腸癌原發(fā)灶，具有明顯不同的惡性潛能，SW620轉(zhuǎn)移潛能較SW480高[13]。培養(yǎng)基為RPMI1640，添加15%胎牛血清（Invitrogen，Rockville，MD），在 37℃、5% CO2、95% 空氣濕度條件下培養(yǎng)、傳代。

1.3 細(xì)胞MEMRI 用胰酶消化對數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞，吹勻后將細(xì)胞混懸液平均分裝于4個(gè)15 ml的Corning離心管內(nèi)。取其中3管，分別加入MnCl2·4H2O（分子量197.91 g/mol，Sigma-Aldrich）溶液配成錳濃度分別為0.05、0.10、0.20 mmol/L的混懸液，吹勻后于37℃、5% CO2環(huán)境中靜置60 min，一方面使細(xì)胞攝取與排出錳離子達(dá)到動態(tài)平衡，另一方面避免過于久置影響細(xì)胞活性。將試管于1000 g條件下離心10 min、吸去部分上清后吹勻，將細(xì)胞混懸液移入1.5 ml Corning離心管。將試管置于1000 g條件下離心10 min、吸去上清后分別加入新鮮培養(yǎng)基吹勻清洗1 min，再次同條件下離心。重復(fù)上述過程3次后，在離心管底部得到厚度近10 mm的細(xì)胞團(tuán)。未加錳劑的細(xì)胞用相同方法制備作為對照。

MR掃描儀為飛利浦3.0T臨床用機(jī)型，采用8通道頭部線圈。機(jī)架孔徑內(nèi)溫度約為25℃，行T1WI及T1 map掃描，均掃描離心管橫斷面。T1WI采用自旋回波序列，TR 597.22 ms，TE 12.40 ms，視野（FOV） 60 mm，層厚 1 mm，間隔 1 mm，采集次數(shù)29，矩陣 144×144。T1 map采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列，TR 3000 ms，TE 18.5 ms，TI 50、100、250、500、750、1000、1250、1500、2000、2500 ms。FOV 60 mm，層厚 1 mm，間隔 1 mm，采集次數(shù) 28，矩陣 144×144。T1 map數(shù)據(jù)導(dǎo)入MatLab（7.0版本）中的軟件進(jìn)行計(jì)算，于試管底部細(xì)胞團(tuán)層面手動勾畫圓形感興趣區(qū)，感興趣區(qū)面積約為7 mm×7 mm。將不加錳劑所測的T1均值減去加入錳劑后所測的T1均值得到平均T1縮短值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件，采用單因素方差分析比較細(xì)胞活力。采用兩因素方差分析比較各細(xì)胞株平均T1縮短值的差異，兩個(gè)因素分別是細(xì)胞株與錳劑濃度，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 錳濃度的確定 正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞CCD841 CoN、低轉(zhuǎn)移人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、高轉(zhuǎn)移人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620在0.20 mmol/L錳濃度下培養(yǎng)60 min，3種細(xì)胞存活率分別為（93±2）%、（96±3）%、（98±1）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.413，P＞0.05），由此確定細(xì)胞MEMRI的錳劑濃度為0.05、0.10、0.20 mmol/L。

2.2 不同錳劑濃度下3種結(jié)腸細(xì)胞的MEMRI效果T1WI直觀顯示細(xì)胞MRI增強(qiáng)情況，見圖1。正常人結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞CCD841 CoN在錳劑存在條件下未見增強(qiáng)。兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和SW620隨錳劑濃度增高而增強(qiáng)。錳劑濃度為0.10、0.20 mmol/L時(shí)，增強(qiáng)程度SW620＞SW480＞CCD841 CoN；錳劑濃度為0.05 mmol/L時(shí)，3種細(xì)胞增強(qiáng)程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 不同濃度錳劑處理后3種細(xì)胞的MRI T1WI

T1 map計(jì)算測值顯示3種細(xì)胞株均不同程度地?cái)z取錳離子。對正常細(xì)胞株而言，3個(gè)錳濃度組間細(xì)胞攝錳程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩種瘤細(xì)胞攝錳程度隨錳劑濃度增高而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。錳濃度為0.05 mmol/L條件下，3種細(xì)胞株平均T1縮短值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；錳濃度分別為0.10、0.20 mmol/L條件下，3種細(xì)胞株平均T1縮短值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。T1 map和T1WI結(jié)果一致。

3 討論

錳離子有5個(gè)不成對的電子，具有強(qiáng)順磁性，能縮短周圍氫質(zhì)子的縱向弛豫時(shí)間增加對比。常規(guī)釓劑Gd-DTPA的增強(qiáng)效果主要依賴腫瘤血供程度，錳劑更多地依賴細(xì)胞對錳離子的攝取。近年研究發(fā)現(xiàn)MEMRI應(yīng)用于腫瘤診斷，包括檢出早期較小瘤灶、反映腫瘤的惡性度以及瘤細(xì)胞的增殖率等。研究腫瘤錳增強(qiáng)效果的影響因素有助于理解成像表現(xiàn)，為進(jìn)一步拓展該技術(shù)的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸正常與癌細(xì)胞株為對象，進(jìn)行體外MEMRI檢測，觀察不同錳濃度條件下不同細(xì)胞株的錳強(qiáng)化表現(xiàn)。

表1 不同濃度錳劑處理后3種細(xì)胞株平均T1縮短值比較（±s，ms）

表1 不同濃度錳劑處理后3種細(xì)胞株平均T1縮短值比較（±s，ms）

注：1.為相同濃度錳劑處理時(shí)3種細(xì)胞株間平均T1值縮短比較所得F值和P值；2.為相同細(xì)胞株不同錳濃度處理時(shí)平均T1值縮短比較所得F值和P值

錳濃度（mmol/L） CCD841 CoN SW480 SW620 F值1 P值10.05 52.72±2.06 52.78±1.96 50.89±0.25 1.264 ＞0.05 0.10 53.53±2.86 127.77±2.83 289.33±0.57 7923.965 ＜0.001 0.20 54.62±3.23 228.15±3.00 468.28±1.46 18 053.632 ＜0.001F值2 0.358 3345.148 156 491.928 — —P值2 ＞0.05 ＜0.001 ＜0.001 — —

細(xì)胞生存需要攝取錳離子維持功能，不論正常細(xì)胞還是瘤細(xì)胞均攝取錳離子。本研究結(jié)果表明，當(dāng)錳濃度逐漸增加時(shí)，正常細(xì)胞攝錳變化不明顯，瘤細(xì)胞攝錳程度則逐漸增加，與No fi ele等[10]報(bào)道的人乳腺癌細(xì)胞株體外攝錳的MEMRI實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。MEMRI檢測腫瘤時(shí)可以通過增加錳劑濃度獲得腫瘤與正常組織之間盡可能大的信號差別，從而提高病灶檢出率。錳濃度越高，T1值縮短越明顯，但同時(shí)其細(xì)胞毒性也更大。將錳濃度控制在細(xì)胞活性不受明顯影響、同時(shí)兼顧增強(qiáng)效果的水平是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。細(xì)胞需要微量錳離子來維持生理功能，如線粒體內(nèi)的錳超氧化物歧化酶需要結(jié)合錳離子而激活來清除代謝產(chǎn)物中的氧自由基。正常細(xì)胞具有健全的自我調(diào)節(jié)、保護(hù)機(jī)制，能夠控制所需錳離子的攝入量，在外界錳濃度提高時(shí)仍能維持正常的攝錳水平。瘤細(xì)胞功能發(fā)生異常，缺乏有效的調(diào)節(jié)機(jī)制，導(dǎo)致外界錳離子無限制內(nèi)流入瘤細(xì)胞，故其攝錳量隨外界錳濃度提高而持續(xù)增加。

本實(shí)驗(yàn)采用的兩種瘤細(xì)胞株為同一患者來源的結(jié)腸癌細(xì)胞株，兩者的性狀差異主要表現(xiàn)為具有不同的轉(zhuǎn)移潛能。當(dāng)錳濃度從0.05 mmol/L提高到0.10、0.20 mmol/L時(shí)，高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞SW620細(xì)胞株表現(xiàn)出高于低轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的攝錳能力，提示瘤細(xì)胞攝錳除受外界錳濃度影響外，還受細(xì)胞株本身生物學(xué)性質(zhì)的影響。No fi ele等[10]也發(fā)現(xiàn)相同條件下，侵襲性高的人乳腺癌細(xì)胞株體外攝錳能力明顯高于其他惡性程度低的細(xì)胞株。既往研究認(rèn)為瘤細(xì)胞攝錳能力與細(xì)胞增殖周期有關(guān)[8,14]。Braun等[8]發(fā)現(xiàn)增殖率高的瘤細(xì)胞攝錳較增殖率低者更明顯。據(jù)此推測，可以依據(jù)瘤細(xì)胞的MEMRI強(qiáng)化差異間接判斷瘤細(xì)胞的惡性程度，其他種類的瘤細(xì)胞株及在體腫瘤MEMRI是否表現(xiàn)相同的現(xiàn)象仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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（本文編輯 饒亞嵐）

Impact of Manganese Concentration on Manganese-enhanced Magnetic Resonance Imaging in Different Colon Cancer Cell Lines

PurposeManganese (Mn) concentration is one of the basic factors that have impact on manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) enhancement of neoplasm. This study aims to elucidate the impact of Mn concentration on enhancement of MEMRI in different colon cancer cells.Materials and MethodsThe human colon cancer cell SW620 with high metastatic potential, SW480 with low metastatic potential and the normal cell CCD841 CoN were performed MEMRI under different Mn concentrations (0,0.05, 0.10 and 0.20 mmol/L)in vitro. The average values of T1 shortening were calculated by T1 map scan in different cells under different Mn concentrations.ResultsWhen the concentration of Mn was 0.10 and 0.20 mmol/L, the average value of T1 shortening of the three cell lines was SW620＞SW480＞CCD841 CoN (P＜0.01). There was no significant difference in the average T1 value of the normal cell lines under different Mn concentrations (0.05, 0.10, 0.20 mmol/L) (P＞0.05). The average T1 value of two tumor cells increased with the increase of Mn concentration. Under the condition of high Mn concentration (0.10 and 0.20 mmol/L), SW620 took in more Mn than SW480.ConclusionColon cancer cells increase Mn uptake with increasing of Mn concentration. MEMRI can distinguish colon cancer cells with different metastatic potential.

Colorectal neoplasms; Magnetic resonance imaging; Image enhancement;Tumor cells, cultured; Manganese

1. 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像科 云南昆明 650030

2. 云南中醫(yī)學(xué)院生理病理學(xué)教研室 云南昆明 650030

3. 昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 昆明呈貢650000

韓 丹

Department of Radiology, the First Af fi liated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650030, China

Address Correspondence to:HAN Dan

E-mail: kmhandan@sina.com

R445.2；R730.4

2017-03-25

2017-06-08

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2017年 第25卷 第8期：572-574，578

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (8): 572-574, 578

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.08.003