陳丹飛1， 朱永琴1， 張源1， 王林燕2， 魏穎慧2*

（1 浙江中醫(yī)藥大學 附屬第一醫(yī)院， 浙江 杭州 310006；

2 浙江中醫(yī)藥大學 藥學院， 浙江 杭州 310053）

[摘要]合成聚乙二醇聚己內酯聚乙烯亞胺（PEGPCLPEI）三嵌段聚合物載體材料，制備包載大黃酸（RH）的PEGPCLPEI納米粒（PPPRHNPS），并評價其理化性質和體外生物學特性。通過開環(huán)聚合和麥克爾加成反應合成得到PEGPCLPEI聚合物，相對分子質量為95×103，臨界膠束濃度為0723 nmol·L-1。包載RH制備得到PPPRHNPS，外觀淺黃、乳光明顯，透射電鏡觀察納米粒分散均勻圓整無團聚，粒徑為（1183±36）nm，PDI為（019±008），Zeta電位為（63±15）mV，包封率為（9364±528）%，載藥量為（857±053）%。透析法考察PPPRHNPS體外釋藥特征，48 h內累積釋放率為7592%，釋藥曲線符合Higuchi模型方程：Q=0121 6t1/2+0069 5（R2=0887 4），呈緩釋特性。選用兔紅細胞考察其溶血率，MTT法評價其對HK2細胞的生物安全性，在0～005 mmol·L-1不會引起紅細胞溶血和細胞毒性。流式細胞儀考察其攝取效率，PPPRHNPS可被細胞迅速內吞，攝取效率高，30 min內攝取完全，經激光共聚焦顯微鏡觀察，PPPRHNPS能夠從溶酶體進入細胞質，具有溶酶體逃逸特性。因此，該研究成功合成PEGPCLPEI聚合物和制備得到PPPRHNPS，粒徑分布均勻，包封率及載藥量較高，攝取迅速，具有緩釋特征、溶酶體逃逸特性、優(yōu)良的生物安全性，是一種良好研究前景的新型納米制劑。

[關鍵詞]大黃酸； 聚乙二醇聚己內酯聚乙烯亞胺； 納米粒； 體外評價

Preparation and in vitro evaluation of rheinloaded

PEGPCLPEI nanoparticles

CHEN Danfei1， ZHU Yongqin1， ZHANG Yuan1， WANG Linyan2， WEI Yinghui2*

（1. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310006， China；

2College of Pharmaceutical Science， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）

[Abstract]This study was aimed to synthesize the polyethyleneglycolpolycaprolactonepolyethyleneimine （PEGPCLPEI） three block polymer material， prepareRhein （RH）loaded PEGPCLPEI nanoparticles（PPPRHNPS）， and then evaluate their physical and chemical properties and biological characteristics in vitro PEGPCLPEI polymer was obtained by adopting theringopening polymerization and Michael addition reaction， and their physical and chemical properties were analyzed by using NMR and gel permeation chromatography PEGPCLPEI was then used as the carriers to prepare PPPRHNPS by applying spontaneous emulsification solvent diffusion method The results showed that molecular weight of PEGPCLPEI polymer was 95×103， and critical micelle concentration was 0723 mmol·L-1 PPPRHNPS had pale yellow， opalescence faade， round and smooth without aggregation， formed of （1183（36） nm in particle size with PDI of （019±008）， Zeta potential of （63±15） mV， entrapment efficiency of （9364±528）%， and drug loading of （857±053）% The accumulative release percentage of PPPRHNPS was 7592% in 48h， and the release profiles in PBS conformed to the Higuchi equation： Q=0121 6t1/2+0069 5 （R2=0887 4）， presenting slow release characteristics Within the scope of the 0005 mmol·L-1， the nanoparticles had no obvious hemolysis on rabbit red blood cells and toxicity on HK2 cells In the investigation of uptake efficiency by flow cytometry， nanoparticles can be absorbed into cells quickly and internalized within 30 minutes fully， with a high uptake efficiency In confocal laser scanning microscope observation， the nanoparticles can escape from lysosome into cytoplasm Herein， this study synthesized the PEGPCLPEI polymer and prepared PPPRHNPS successfully； the nanoparticles showed uniform particle size， higher encapsulation efficiency and drugloading rate， slow release characteristics， quick uptake and internalization， lysosome escape property and good biocompatibility PPPRHNPS will be a promising pharmaceutical formulation for further developmentendprint

[Key words]rhein； PEGPCLPEI； nanoparticles； property evaluation

大黃酸（rhein，RH）為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L、唐古特大黃R tanguticum Maxim ex Balf等傳統(tǒng)中藥分離提取的有效成分，屬于單蒽核類1，8二羥基蒽醌衍生物，藥理研究證實，RH可顯著抑制腎小球系膜細胞的增生、肥大以及細胞外基質的產生[1]，同時RH能抑制人腎小管上皮細胞TSP1，TGFβ1的mRNA轉錄和蛋白表達，保護腎臟固有功能[23]，在對腎臟疾病的干預中發(fā)揮著多靶點多層次的治療作用。但是，RH溶解性差、半衰期短、腎臟富集率低、生物利用度低[4]、且具有一定的肝毒性，限制了其臨床應用。有研究者采用新型納米粒作為藥物載體，包載RH后進行遞藥輸送，能夠提高RH的水溶性、延長半衰期和賦予緩控釋的特點[5]。但是普通納米粒經細胞攝取后會直接進入溶酶體，溶酶體作為細胞的“垃圾處理站”，其富含大量各類酸性水解酶，對進入其中的各類物質進行消化和分解，從而使藥物喪失活性，極大降低了納米遞藥系統(tǒng)的療效[67]。因此，研究包載RH且具備溶酶體逃逸功能的納米粒對提高RH的藥效和促進RH的臨床轉化具有重要意義。

聚乙烯亞胺（PEI）是一類廣泛應用于核酸遞藥的陽離子聚合物，其分子結構由大量的各級胺構成，在生理條件下分子中僅有15%～20%的胺質子化，對生理環(huán)境的不同pH有很強的緩沖能力，可以有效提高遞藥體系的穩(wěn)定性；當被細胞攝取進入溶酶體后，由于溶酶體內pH較低，分子中大于70%的胺被質子化，能夠大量捕獲質子，引起氯離子內流進入溶酶體，溶酶體內的滲透壓不斷升高，最終使溶酶體破裂從而將內吞的載體和藥物釋放到細胞質，而后發(fā)揮藥理作用[89]。因此，在前期實驗的基礎上，本研究擬通過邁克爾加成反應，將PEI化學偶聯至聚乙二醇聚己內酯上，合成三嵌段聚合物聚乙二醇聚己內酯聚乙烯亞胺（PEGPCLPEI），合成具備溶酶體逃逸功能的聚合物。以PEGPCLPEI為藥物載體，以包封率、載藥量和粒徑為主要指標，制備包載RH的PEGPCLPEI納米粒（PPPRHNPS），并進行藥劑學特性評價；透析法考察其體外釋藥特性、MTT法評價其對HK2細胞的生物安全性、流式細胞儀考察其攝取效率、共聚焦顯微鏡考察其溶酶體逃逸特性，為PPPRHNPS體內藥效學研究奠定基礎，并為RH及同類藥物的新型納米制劑的研究提供參考。

1材料

RH原料藥（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98%，批號201307）；RH對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110757200206）；聚乙二醇單甲醚（PEG，相對分子質量2×103）、己內酯、辛酸亞錫、丙烯酰氯、BOC丙氨酸、13′二甲氨基丙基3乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N羥基琥珀酰亞胺（NHS）（安耐吉化學薩恩化學技術有限公司）；聚乙烯亞胺（PEI，相對分子質量18×103）、噻唑藍（MTT）（上海阿拉丁試劑有限公司）；泊洛沙姆188（德國巴斯夫公司）；Cy5N羥基琥珀酰亞胺酯（Cy5NHS）（杭州墨丘利生物醫(yī)藥科技有限公司）；甲醇（美國Honeywell公司）；磷酸（美國TEDIA公司）； DMEM培養(yǎng)基（添加有45 g·L-1葡萄糖、37 g·L-1碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺、100 mg·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素）、025%胰蛋白酶溶液（美國Gibco公司）；細胞核染料Hoechst 33342、溶酶體綠色染料LysoTracker Green DND99（美國Thermo Fisher Scientific公司）；N，N二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、三乙胺等均為國產分析純。

Bruker Avance400型核磁共振儀（德國Bruker公司）；NanoZS 90激光粒度分析儀（英國Malvern公司）；Agilentl200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）； JEM1200EX透射電鏡（日本電子株式會社）； Waters1515型凝膠色譜儀（美國Waters公司）；SpectraMaxM5多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）；ST16R臺式離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；MillQ超純水儀（美國Millpore公司）； Thermo Scientific Forma Ⅱ CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；MD200氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；DZF6020真空干燥箱（廣州康恒儀器有限公司）；CP225D電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；等。

兔紅細胞（浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供）；HK2細胞（源于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）。

2方法

21載體材料的合成與表征

211PEGPCL和PEGPCLPEI的合成聚乙二醇單甲醚（PEG）和已內酯嚴格除水后使用，取50 mL圓底燒瓶加熱抽真空干燥后，在氮氣保護下依次加入PEG（2 g，1 mmol）、己內酯（10 mL，90 mmol）、辛酸亞錫（082 g，2 mmol），于110 ℃攪拌反應24 h，冷卻后將混合物溶解在少量二氯甲烷中，用冰乙醚沉淀3次，最后砂芯漏斗過濾，固體抽真空干燥得到PEGPCL約6 g，產率約75%。

取PEGPCL（2 g，025 mmol）溶解于無水的二氯甲烷20 mL中，加入無水的三乙胺1 mL，氮氣保護，緩慢滴加丙烯酰氯80 μL，室溫攪拌反應6 h后，飽和食鹽水萃取3次，每次20 mL，有機相旋蒸濃縮后，用冰乙醚沉淀，砂芯漏斗過濾，固體抽真空干燥得到PEGPCLCOCHCH2約12 g，產率約60%。

取PEGPCLCOCHCH2（1 g，0125 mmol）和PEI（036 g，02 mmol）溶解于10 mL DMF中，加入1 mL吡啶，60 ℃攪拌反應12 h，將反應液倒入截留相對分子質量為10×103透析袋，首先于DMF中透析24 h，后轉移到純水中透析24 h，最后經冷凍干燥得到淡黃色固體PEGPCLPEI約08 g，產率約65%。endprint

通過核磁共振儀測定所得產物的核磁共振氫譜（1HNMR），采用凝膠色譜儀測定所得聚合物的相對分子質量及相對分子質量分布曲線。采用熒光法測定PEGPCL和PEGPCLPEI的臨界膠束濃度（CMC）：以芘為熒光探針，溶于丙酮配制20 mg·L-1母液，取離心管，每管加入100 μL母液，自然揮干丙酮后，加入1 mL一系列濃度的聚合物混懸液，最終芘質量濃度為2 mg·L-1，室溫置于搖床中搖動過夜，酶標儀測定聚合物混懸液中芘的熒光光譜，固定最大發(fā)射波長為390 nm，掃描芘在300～360 nm激發(fā)光譜圖，計算各濃度下激發(fā)光譜圖338，333 nm熒光強度的比值（I338/I333），繪制聚合物濃度與I338/I333曲線，計算曲線拐點處濃度為聚合物CMC。

212熒光標記的PEGPCL和PEGPCLPEI的合成取PEGPCL（1 g，0125 mmol）、BOC丙氨酸（189 mg，1 mmol）、EDC（48 mg，025 mmol）和NHS（30 mg，025 mmol）溶于10 mL二氯甲烷中，室溫攪拌反應12 h，冰乙醚沉淀后，固體溶于20 mL二氯甲烷中，加入2 mL三氟乙酸攪拌1 h，飽和食鹽水萃取3次，每次20 mL，有機相旋蒸濃縮后，用冰乙醚沉淀，固體抽真空干燥，得到氨基修飾的PEGPCLCOCH2CH2NH2（PEGPCLNH2）約045 g，產率約41%。

分別取PEGPCLNH2和PEGPCLPEI各200 mg，分別溶于5 mL的DMF中，各加入Cy5NHS 1 mg和075 mg（按照理論摩爾接枝率5%投料），避光45 ℃攪拌反應24 h，將反應液倒入截留相對分子質量為35×103透析袋中，首先于DMF透析12 h，后轉移到純水中透析24 h，最后經冷凍干燥得到藍色固體粉末即Cy5標記的PEGPCL（PEGPCLCy5）和Cy5標記的PEGPCLPEI（PEGPCLPEICy5）。使用低相對分子質量35×103透析膜進行透析純化，聚合物基本沒有損失。經酶標儀掃描熒光波譜強度，按摩爾比計算，PEGPCLCy5和PEGPCLPEICy5熒光接枝率分別約為32%和39%。

22藥物測定方法的建立

精密配制濃度為010 g·L-1的RH對照品母液，稀釋至質量濃度為01，05，1，5，10，20，40，80 mg·L-1系列溶液，采用HPLC進行測定。色譜柱Platisil ODS型（46 mm×150 mm，5 μm），流動相甲醇01%磷酸（75∶25），流速10 mL·min-1；柱溫25 ℃，檢測波長254 nm，以峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標擬合標準曲線。取1，10，40 mg·L-1的3種濃度RH溶液，分別在日內測定5次并且連續(xù)測定3 d，計算RH的日內、日間精密度。按處方量的80%，100%，120%精密稱取RH，分別加入處方比例的輔料，攪拌混合，用甲醇溶解定容后，經022 μm微孔濾膜過濾后測定藥物濃度，計算RH回收率。

23納米粒的制備和表征

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備PPPRHNPS：稱取適量RH和20 mg PEGPCLPEI溶于2 mL體積比為2∶1的丙酮甲醇的混合溶劑中，構成有機相；另取10 mL質量分數為1%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（泊洛沙姆188）水溶液作為水相；800 r·min-1攪拌下將有機相以緩慢滴加到水相中，滴畢，繼續(xù)攪拌30 min，減壓蒸出有機溶劑和部分水，調整體積至10 mL，即得到具有黃色乳光的PPPRHNPS混懸液。同法制備載RH的PEGPCL納米粒（PPRHNPS）、熒光標記的納米粒PPPCy5RHNPS和PPCy5RHNPS，以及未載藥的空白納米粒PPPNPS和PPNPS。

取少量PPPRHNPS混懸液，蒸餾水稀釋后經粒徑儀測定其平均粒徑及Zeta電位。取一滴PPPRHNPS混懸液滴于銅網上，放于烤燈下蒸干溶劑，經20%磷鎢酸溶液負染，置于透射電子顯微鏡觀察其微觀形貌特征。精密量取1 mL PPPRHNPS混懸液置于離心管中，于2×104 r·min-1離心30 min，取上清液經HPLC測定游離的RH濃度，計算包封率和載藥量。

24體外釋藥特性考察

選擇含2%聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（吐溫80）的pH 74 PBS緩沖液作為釋放介質，采用透析法考察PPPRHNPS體外釋藥特性：分別取PPPRHNPS混懸液、PPRHNPS混懸液和RH溶液（RHsol）適量（折合RH質量為05 mg）加入透析袋內，用透析夾封口后置于200 mL釋放介質中，放于37 ℃恒溫水浴振蕩（60 r·min-1）中恒溫振蕩，分別于025，05，1，2，3，4，6，8，12，24，48 h取釋放介質1 mL，補加等量空白釋放介質，試樣處理后經HPLC測定RH含量，計算累積釋放百分率（Q），繪制并擬合體外釋藥曲線。

25體外溶血實驗

取抗凝后的新鮮兔血，加入離心管，于2 000 r·min-1離心5 min去除上層血清和蛋白后，用pH 74的PBS緩沖液重懸沖洗并離心3次，直至上清液不顯紅色，最后PBS緩沖液稀釋配制濃度約為1×108個/mL紅細胞儲備液。在離心管中加入一定質量濃度的PPPNPS混懸液和PPNPS混懸液，PBS緩沖液稀釋至系列梯度濃度，使得總體積為900 μL，最后加入100 μL的紅細胞儲備液。將離心管置于37 ℃恒溫搖床中振蕩，2 h后，于2 000 r·min-1離心5 min分離出未破裂的紅細胞。收集上層液200 μL，使用酶標儀測定其在540 nm處的吸光度（A）。以相應PBS溶液作為陰性對照，純水溶液作為陽性對照，計算溶血率（hemolysis ratio），溶血率=（A樣-A陰）/（A陽-A陰） ×100%。

26細胞毒性實驗

取對數生長期HK2細胞，025%胰蛋白酶消化、收集、離心后，用DMEM培養(yǎng)基稀釋細胞至密度為5×104個/mL，取96孔板，每孔加入180 μL，穩(wěn)定12 h后，實驗組分別加入系列梯度濃度的納米制劑混懸液20 μL，對照組加入等量的PBS，各組平行6孔。48 h后每孔加入20 μL的 5 g·L-1 MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，離心棄上清后加入200 μL 二甲亞砜，置于振蕩器上振蕩1 min，以570 nm為檢測波長和以620 nm為校正波長，用酶標儀測定的吸光度（A），計算細胞存活率（cell viability），細胞存活率=A實驗組/ A對照組×100%。endprint

27細胞攝取效率考察

將對數生長期的HK2細胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至密度為1×105個/mL的細胞懸液，取12孔板，每孔加入1 mL細胞懸液，穩(wěn)定培養(yǎng)12 h。于一定的時間點加入100 μL等量熒光強度的PPPCy5RHNPS或PPCy5RHNPS，使其孵育0，025，05，1，15，2，3 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，胰酶消化，收集細胞，采用流式細胞儀測定HK2細胞在不同孵育時間攝取各納米制劑的平均熒光強度，繪制攝取速率曲線，評價HK2對各納米制劑的攝取效率。

28細胞攝取機制考察

將對數生長期的HK2細胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋至密度為1×105個/mL的細胞懸液，取規(guī)格為35 mm的玻底培養(yǎng)皿，每皿加入1 mL細胞懸液，穩(wěn)定培養(yǎng)24 h。采用激光共聚焦顯微鏡觀察PPPCy5RHNPS和PPCy5RHNPS的細胞攝取過程及胞內分布：首先按照Hoechst 33342試劑盒和LysoTracker Green DND99試劑盒操作指南，每皿加入02 μL LysoTracker Green DND99標準液，20 min后每皿滴加2滴Hoechst 33342標準液，孵育30 min后，吸取培養(yǎng)基，PBS沖洗一遍，加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，然后加入100 μL PPPCy5RHNPS或110 μL PPCy5RHNPS混懸液，分別于孵育15 min，1 h和3 h觀察，激光共聚焦顯微鏡分別選取DAPI通道、488 nm通道和640 nm通道3個光源通道，考察各納米制劑的細胞攝取過程及胞內分布情況。

3結果

31載體材料的表征

聚合物PEGPCLPEI的合成路線見圖1A，圖1B為PEGPCL的1HNMR（CDCl3，400 Hz）δ：138[10077H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，163[20045H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，229[9989H，OCOCH2]，338（3H，CH3O），365[18055H，CH2CH2O]，406[9823H，CH2OCO]，通過聚乙二醇上單甲氧基的3個氫為基準，推算出合成的PEGPCL的相對分子質量約為77×103（2 000+100/2×114 =7 700）。圖1C為PEGPCLCOCHCH2的的1HNMR圖譜，峰位和大小與B圖一致，多出的1組峰為反應結合丙烯酰的3個氫，55～65（359H，OCOCHCH2），積分氫數量大于理論值，表明產物中有少量未除盡的丙烯酰，并不影響下一步反應。圖1D為PEI的核磁圖譜，其相對分子質量為18×103，積分約為170個氫，256[170H，CH2CH2NH]。圖1E為最終合成得到的PEGPCLPEI，1HNMR（CD3OD，400 Hz）：由于單甲氧基與甲醇的溶劑峰重合，因而采用聚乙二醇主鏈上的180個氫作為基準進行校正計算，129[10041H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，153[19987H，COCH2CH2CH2CH2CH2O]，227[9854H，OCOCH2]，355[180H，CH2CH2O]，396[9939H，CH2OCO]，250[195H，CH2CH2NH]，相對分子質量約為98×103（7 700+195/4×43=9 796），通過PEI峰位氫的實際值和理論值對比計算，合成得到的PEGPCLPEI純度約為90%，能夠符合載體材料的純度要求。

各聚合物的相對分子質量及相對分子質量分布曲線見圖2A，PEGPCLPEI相對分子質量分布均一，PDI為108，而PEGPCL和PEI相對分子質量分布曲線范圍更寬，主要由于純化PEGPCLPEI采用相對分子質量高達10×103透析袋進行透析，能夠除掉小相對分子質量的聚合物，使相對分子質量分布曲線范圍更窄。通過儀器自帶聚乙烯做內參的相對分子質量曲線方程，計算得到重均相對分子質量約為95×103，與核磁估算的結果基本一致。選用熒光探針Cy5對PEGPCL和PEGPCLPEI進行熒光標記，經酶標儀掃描熒光波譜強度，按摩爾比計算，PEGPCLCy5和PEGPCLPEICy5熒光接枝率分別約為32%，39%。

采用熒光法測定聚合物的CMC，以338，333 nm熒光強度的比值（I338/I333）與聚合物濃度擬合曲線，曲線拐點處濃度為聚合物CMC[10]。隨著PEGPCL

或PEGPCLPEI聚合物濃度的逐漸增大，芘的激發(fā)光強度迅速增大，最大激發(fā)波長逐漸由333 nm紅移至338 nm，PEGPCL在濃度為02 nmol·L-1附近開始出現熒光強度的突變，PEGPCLPEI在濃度為1 nmol·L-1附近出現明顯的熒光強度的突變，見圖3。通過對I338/I333與聚合物濃度擬合曲線，計算拐點處的濃度，PEGPCL和PEGPCLPEI的CMC分別為0303，0723 nmol·L-1。PEGPCLPEI的CMC大于PEGPCL的原因主要由于其分子中引入的嵌段PEI為親水性結構，與疏水嵌段PCL偶聯后在一定程度上會阻礙疏水內核結構的形成，隨著濃度的增加，疏水嵌段PCL的強大疏水作用最終占據主導，促成自組裝形成膠束結構。

32藥物測定

經HPLC測定，以峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標擬合標準曲線，RH在05～40 mg·L-1呈良好的線性關系，回歸方程A=71272C-12817，R2=0999 8。低中高濃度RH溶液的日內和日間精密度RSD分別為054%，047%，058%和105%，086%，072%，均小于2%。按處方量的80%，100%，120%加入RH后，回收率分別為（9663±238）%，（9701±075）%，（9727±156）%，均符合方法學要求。

33納米粒制劑的表征

制備得到的PPPRHNPS混懸液呈淺黃色、乳光明顯，經熒光探針Cy5標記后PPPCy5RHNPS呈現一定的淡藍色，測得平均粒徑為（1183±36）nm，PDI為（019±008），Zeta電位為（63±15）mV，見圖4。用透射電鏡觀察，PPPRHNPS呈圓球顆粒，大小均勻，分布良好，粒子之間未見明顯粘連及團聚現象。制備得到的其他納米粒制劑粒徑均分布在100 nm左右，PDI在01～03，見表1。以PEGPCL為載體所制備的納米粒均帶負電，而以PEGPCLPEI為載體所制備得到的納米粒均帶正電，這主要由于嵌段PEI中各級胺的質子化賦予了納米粒正電特性。采用高速離心法考察各納米制劑的包封率和載藥量，經HPLC測定，PPRHNPS和PPPRHNPS包封率分別為（4736±381）%和（9364±528）%，載藥量分別為（231±038）%和（857±053）%，PEGPCL中引入嵌段PEI后能夠顯著提高RH的包封率和載藥量。endprint

34體外釋藥考察

RH原藥、PPRHNPS和PPPRHNPS的釋藥曲線見圖5，RH原藥在釋放介質中釋藥很快，4 h內時藥物累計釋放率接近90%。PPRHNPS釋藥行為可以分為突釋和緩釋兩相，開始時釋放較快，3 h時藥物的累積釋放率為5514%，隨后釋藥曲線漸趨平穩(wěn)，緩慢釋藥，于48 h時累積釋放率為9127%。PPPRHNPS釋藥曲線更加平穩(wěn)，具有明顯的緩控釋特性，3 h內藥物的累積釋放率為3126%，沒有顯著的突釋現象，于48 h內累積釋放率為7592%。PPRHNPS中RH主要以疏水作用的物理包埋方式載入納米粒中，載藥不穩(wěn)定，釋放較快；而PPPRHNPS中除了物理包埋方式，RH中的羧酸根以及酚羥基與嵌段PEI的多級胺能夠酸堿離子結合，主要以離子對的形式包載，載藥更加穩(wěn)定，釋藥平穩(wěn)而緩慢。

采用經典的零級動力學模型、一級動力學模型、Higuchi模型對PPPRHNPS體外釋藥特性進行方程擬合，見表2，PPPRHNPS在PBS緩沖液中的釋藥行符合Higuchi模型方程，為Q=0121 6t1/2+0069 5（R2=0887 4）。

35細胞溶血和細胞毒性考察

采用兔紅細胞考察PPNPS和PPPNPS細胞溶血現象，見圖6A，隨著聚合物濃度的增加，PPNPS

和PPPNPS均出現溶血現象，在低于005 mmol·L-1時紅細胞溶血率小于5%，具有良好的溶血耐受性。采用MTT法測定了PPNPS和PPPNPS對HK2的細胞毒性，見圖6，孵育48 h后，在聚合物濃度達到01 mmol·L-1時，HK2細胞的存活率仍然保持在90%以上，具備良好的生物安全性。此外，在相同濃度下，PPPNPS比PPNPS具有更高的溶血率和細胞毒性，主要因為PEGPCLPEI聚合物中的嵌段PEI具有較強的正電特性，其結構中多級胺所生成的銨鹽能夠引起紅細胞溶血和細胞毒性，這一問題也是陽離子聚合物及陽離子脂質體等新型納米制劑普遍存在的弊端[11]。由于PPPNPS包載RH具有較高的包封率和載藥量，能夠以較低的濃度滿足給藥劑量，在0～005 mmol·L-1，不會引起紅細胞溶血和細胞毒性，仍具備良好的生物相容性。

36細胞攝取效率考察

納米制劑在不同時間點的攝取情況見圖7，各納米粒制劑隨著孵育時間的延長不斷被攝取進入細胞中，熒光強度及計數陽性率不斷增加。PPCy5RHNPS攝取較緩慢，在90 min時能夠達到被完全攝取，而PPPCy5RHNPS攝取十分迅速，15 min內約有60%的納米粒制劑被攝取進入細胞，30 min基本達到完全攝取，具有較高的攝取效率。由于細胞膜表

37細胞攝取機制考察

激光共聚焦顯微鏡觀察PPCy5RHNPS和PPPCy5RHNPS攝取入胞過程，見圖8，PPCy5RHNPS攝取入胞較為緩慢，15 min只有極少的納米粒攝取進入細胞（紅色部分），1 h時大部分進入細胞，但是攝取入胞的納米粒處置進入溶酶體，3 h時納米粒仍然完全分布在溶酶體內（綠色和紅色完全重合，顯黃色），如果藥物無法從溶酶體中盡快逃逸釋放進入細胞質中，可能會被逐漸分解變質而喪失活性。PPPCy5RHNPS細胞攝取較為迅速，15 min時大量粘附于細胞膜表面周圍（紅色圓環(huán)）并攝取入胞，1 h內完全攝取并分布于溶酶體中，3 h時可見有大量納米粒逃逸出溶酶體擴散進入細胞質（紅色分布整個細胞并只有少量與綠色重合），從而使藥物發(fā)揮療效。此種溶酶體逃逸特性正是由于PPPCy5RHNPS中嵌段PEI具有大量荷正電的氨基，在質子海綿效應作用下，溶脹破裂溶酶體，使PPPCy5RHNPS逃逸出溶酶體，最后釋放藥物。

4討論

納米粒作為新型藥物載體，能夠包載RH等難溶性藥物進行遞藥輸送，可以提高難溶性藥物的水溶性、延長半衰期和賦予緩控釋的特點，從而提高藥物療效。大部分嵌段聚合物制備得到的納米粒主要通過相似相溶原理依賴其疏水性內核區(qū)來包載藥物，少量吸附于納米粒的表面和殼層內，往往難以達到理想的包封率和載藥量[1213]。雖然有研究報道采用介孔結構的無機納米粒能夠具備極高的包封率和載藥量，但是受限于體內難降解和生物相容性差而無法實現臨床轉化[14]。目前有較多研究者采用共價偶聯制備前藥納米粒、超分子組裝體和聚集體、金屬絡合物以及酸堿離子對等方法提高納米粒的包封率和載藥量，本研究合成制備的三嵌段聚合物PEGPCLPEI中嵌段PEI具有大量的多級胺，在生理環(huán)境中顯堿性，帶正電，RH具有羧酸基團和酚羥基團，顯酸性，帶負電，兩者可以形成酸堿離子對，從而包載RH具有較高的包封率和載藥量。

統(tǒng)計研究發(fā)現，采用納米遞藥系統(tǒng)在治療各類疾病的研究中，往往難以達到預期治療效果，主要由于納米遞藥體系發(fā)揮療效依賴于最終輸送至靶點的有效藥量[1516]。大多數載藥納米粒經過血液循環(huán)、體內分布、進入組織器官，經細胞攝取吞噬后會直接進入溶酶體，而溶酶體不是藥物的作用靶點，其作為細胞的“垃圾處理站”，富含大量酸性水解酶，能對進入其中的各類外源性物質和內源性廢物進行消化和分解，如果載藥納米粒不能夠及時從溶酶體逃逸進入細胞質，藥物就可能失去活性，極大降低納米遞藥系統(tǒng)的療效。PEI在基因遞藥系統(tǒng)中被廣泛用于溶脹溶酶體，促進核酸藥物的溶酶體逃逸[89]，其分子結構由大量的各級胺構成，由于溶酶體內pH較低，分子中的胺被質子化，引起氯離子內流進入溶酶體，溶酶體內的滲透壓不斷升高，使溶酶體破裂從而將內吞的載體納米粒釋放到細胞質，接觸作用靶點。本研究運用PEI的特性，偶聯嵌段PEI至聚乙二醇聚己內酯聚合物上，不僅能夠促進載RH的納米粒從溶酶體逃逸，而且能夠賦予納米粒正電的特性，大大提高了納米粒的攝取效率。

本研究成功合成了三嵌段聚合物PEGPCLPEI，制備了包載大黃酸的PEGPCLPEI納米粒，該納米粒包封率和載藥量較高，粒徑分布均勻，體外釋藥具有緩釋特性，表面荷正電，細胞攝取迅速，具備溶酶體逃逸的特性，具有良好的生物安全性。本研究為納米粒體內藥效學考察奠定基礎，為RH及同類藥物新型納米制劑的研究提供參考。endprint

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[責任編輯孔晶晶]endprint