雄英 李明珍 張攀攀 張理意 楊躍

目前肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)位于前列，對公眾健康造成極大危害。肺癌的死亡人數(shù)在過去的三十年上升了465%，約增長了5倍，已經(jīng)成為我們國家惡性腫瘤死亡原因中第一位。所以現(xiàn)在人們把肺癌稱為我們國家癌癥領(lǐng)域的“第一殺手”。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發(fā)病率占到了85%，主要包括腺癌、鱗癌以及大細(xì)胞癌，其中肺鱗癌是最常見的病理類型之一，占NSCLC的30%-40%[1,2]。肺鱗癌又稱肺鱗狀上皮細(xì)胞癌，以中央型肺癌多見，并有胸管腔內(nèi)生長的傾向，早期常引發(fā)支氣管狹窄或阻塞性肺炎[2]。

目前分子靶向治療的出現(xiàn)徹底改變了癌癥治療格局。在肺腺癌中，分子靶向治療獲得了較為廣泛的應(yīng)用，但是在肺鱗狀細(xì)胞癌患者的治療中還沒有實現(xiàn)。高通量二代測序作為一種新的實驗技術(shù)，能夠為我們提供詳細(xì)、特異的信息，最重要的是它的正確率和高特異性[3,4]。所以從現(xiàn)實意義的角度出發(fā)，本研究的目的在于利用高通量二代測序技術(shù)，通過查找正常組織與腫瘤組織在基因表達(dá)上的差異，為實現(xiàn)肺鱗癌的分子靶向治療提供基礎(chǔ)。因此，我們針對5對肺癌鱗癌患者的腫瘤組織和正常肺組織進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因，并且對其差異基因SPRR進(jìn)行肺癌細(xì)胞系的驗證，有望為肺鱗癌靶向治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集5例經(jīng)病理診斷為肺鱗癌患者的腫瘤組織及正常肺組織的新鮮標(biāo)本，年齡45歲-65歲。標(biāo)本收集后分立即置于液氮中速凍，保存于-80oC冰箱中，用于實驗檢測。肺癌細(xì)胞系H520、GLC82、A549、H1299及PC9使用1640培養(yǎng)基、37 °C的CO2溫箱培養(yǎng)。

1.2 總RNA提取 取等量肺癌癌組織及正常肺組織，液氮中磨碎；加入TRIZOL Reagent，室溫孵育5 min；加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，室溫孵育10 min；4oC，12,000 rpm，離心15 min。吸取上層含有RNA的水相入新管，加500 μL異丙醇沉淀RNA，室溫孵育10 min；4oC，12,000 rpm，離心15 min。棄上清，加1 mL的75%乙醇洗滌RNA沉淀，4oC，7,500 rpm，離心5 min，用20 pL DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計測定RNA的含量，-80oC冰箱保存。

1.3 轉(zhuǎn)錄組文庫制備及上機(jī)測序 利用Oligo dT微珠富集純化mRNA并進(jìn)行片段化處理，在3末端加堿基A、連接測序接頭，割膠，純化并回收200 bp-500 bp之間的cDNA片段。PCR擴(kuò)增后完成測序文庫的制備。對測序文庫進(jìn)行質(zhì)量控制，構(gòu)件好的文庫用Illumina Hiseq2500進(jìn)行測序，以fastq格式輸出。

1.4 生物信息分析 將轉(zhuǎn)錄組測序樣本，分別用TopHat回貼人基因組，其樣本比對率需達(dá)到90%以上。用Cufflinks分別重新構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本，對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行鑒定，合并轉(zhuǎn)錄本，得到一個統(tǒng)一的轉(zhuǎn)錄本集合。對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行鑒定質(zhì)量的評估后，最后采用cuffdiff鑒定正常組織樣本組和相對應(yīng)的肺癌組織樣本組之間的差異編碼基因。

1.5 實時定量PCR 使用TRIzol提取肺癌細(xì)胞系總RNA，2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒，羅氏480儀器檢測差異基因的表達(dá)。反應(yīng)條件，95oC 5 min；95oC 15 s，60oC 30 s，40個循環(huán)；72oC 5 min。β-actin作為對照，計算公式：2-ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct對照。

2 結(jié)果

2.1 肺鱗癌轉(zhuǎn)錄組概況 利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，檢測5對肺癌組織及正常肺組織的標(biāo)本，利用生物信息學(xué)分析篩選差異基因。用cuffdiff鑒定正常組織樣本組和相對應(yīng)的肺癌組織樣本組之間的差異基因，發(fā)現(xiàn)按照cuffdiff的標(biāo)準(zhǔn)（上下調(diào)2倍；p-value≤0.05；q-value≤0.05），鑒定出來40個差異基因。不考慮q-value之后，差異基因數(shù)目明顯上升，為534個（q-value是基于p-value的再統(tǒng)計，p-value是樣本的一個基本檢驗幾率）。

2.2 篩選肺鱗癌組織高表達(dá)的前10個基因 基于轉(zhuǎn)錄組測序檢測5對配對肺癌組織及正常肺組織的標(biāo)本，重點關(guān)注于肺癌腫瘤組織高表達(dá)的前10個關(guān)鍵基因（表1）。正常肺組織測序的FPKM平均值為0.222,4，肺癌腫瘤組織FPKM平均值為233.4，則腫瘤組織前10位差異基因的表達(dá)量是正常組織的1,049倍。

在這10個基因中，SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3為同一家族成員，其FPKM值在正常肺組織與腫瘤組織中分別為0.430,2和444.72，二者相差1,033倍。其中又以SPRR3在肺腫瘤組織與正常組織之間的差異最大，為1,546倍（表2）。

2.3 肺癌細(xì)胞系中SPRR家族基因的表達(dá)情況 采用熒光定量PCR的方法檢測了前10位差異基因在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，見圖1。H520為肺鱗癌細(xì)胞，GLC82、A549、H1299、PC9為肺腺癌細(xì)胞。其中H1299為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞系，PC9是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）敏感的肺癌細(xì)胞系。從圖1中可以看出SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3在肺癌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，此5類亞型于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的H1299細(xì)胞中均有較高表達(dá)，均高于在未轉(zhuǎn)移的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的表達(dá)水平。

表 1 肺鱗癌組織中高表達(dá)的前10個基因Tab 1 The top ten genes highly expressed in the lung squamous carcinoma

表 2 SPRRs家族基因在正常肺組織與肺癌腫瘤組織中的表達(dá)Tab 2 Expression of SPRRs family in the normal tissues and lung cancer tissues

3 討論

近十年來，基于NSCLC驅(qū)動基因的個體化靶向診治研究拉開了帷幕，并取得了革命性進(jìn)展而應(yīng)用于臨床，例如EGFR突變基礎(chǔ)上的TKIs，基于EML4-ALK融合基因的抑制劑等主要應(yīng)用于肺腺癌[5]。然而，針對肺鱗癌的靶向診治研究十分有限。此外，隨著新一代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序已成為基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄組分析新的重要手段。轉(zhuǎn)錄組測序能夠快速并全面的獲取組織中幾乎所有轉(zhuǎn)錄本RNA的序列信息，是目前常用的高通量分析手段，已成為腫瘤研究的重要技術(shù)支撐。

本研究正是利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測了5對肺癌組織及正常肺組織的基因型的改變，并利用生物信息學(xué)分析篩選出與腫瘤密切相關(guān)的排在前10位的基因，包括SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E、SPRR3、PRAME、MAGEA3、IL36G、GAGE12J、TMPRSS11D。其中，位于差異基因前5位的SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3基因同屬于SPRRs家族，編碼一類富含脯氨酸的蛋白[6]，而有研究表明這些基因亞型在表達(dá)上有一定的偏向性。SPRR1A和SPRR1B基因表達(dá)與口腔上皮細(xì)胞的屏障作用相關(guān)[7]，SPRR2基因亞型在消化道疾病以及皮膚病的炎癥反應(yīng)中表達(dá)水平有所增加[8,9]。

IL36G基因在組織發(fā)生損傷與修復(fù)過程中表達(dá)增高，可見與炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)[10,11]。也有報道顯示IL36G基因與皮膚病的炎性反應(yīng)相關(guān)[12]。據(jù)報道炎癥反應(yīng)能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，并與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示SPRRs家族及IL36G在癌組織高表達(dá)的情況可能參與了炎癥反應(yīng)且具有促進(jìn)肺癌發(fā)生的作用。GAGE12J基因在胎兒和腫瘤組織中表達(dá)，是腫瘤/睪丸抗原家族成員之一。有報道[13,14]發(fā)現(xiàn)其在腦膜瘤和神經(jīng)鞘瘤中可與其他基因相互作用。TMPRSS11D屬于II型跨膜絲氨酸蛋白酶亞家族成員，在宮頸鱗癌和食管鱗癌的形成過程中缺失[15]。PRAME是腫瘤/睪丸抗原的一種，可作為潛在的免疫治療的靶點，其表達(dá)狀態(tài)與上皮性卵巢癌的啟動子低甲基化有關(guān)[16]。MAGEA3同樣也屬于腫瘤/睪丸抗原的一種，ORIS與其啟動子結(jié)合而調(diào)控肺癌的轉(zhuǎn)錄活性[17]。

圖 1 柱狀圖顯示SPRRs家族基因包括SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況（2-ΔCt value）。Fig 1 The histogram shows expression of SPRRs family genes including SPRR1A, SPRR1B, SPRR2D, SPRR2E and SPRR3 in the lung cancer cells lines (2-ΔCt value).

我們進(jìn)一步在肺癌細(xì)胞系中檢測差異基因SPRRs家族的表達(dá)狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系H1299中，SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3均呈高表達(dá)狀態(tài)。前期的研究發(fā)現(xiàn)SPRRs家族基因在膽管上皮細(xì)胞中能夠增加對損傷的抵抗，并與EMT密切相關(guān)[18]。另有研究[19]表明長鏈非編碼RNA MALAT-1通過調(diào)控SPRRs家族基因而影響了舌鱗狀細(xì)胞癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。而我們的研究亦發(fā)現(xiàn)此家族基因在局部轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中高表達(dá)，提示有可能在肺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。

目前隨著臨床研究的深入，證明了個體化的腫瘤治療相比傳統(tǒng)的方法更加安全有效。而本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，通過查找正常肺組織與肺癌腫瘤組織在基因表達(dá)上的差異，為實現(xiàn)肺鱗癌的分子靶向治療以及尋找更多的分子治療靶點提供了可行性。