石巖 呂望 汪路明 胡堅

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，肺癌病例占到所有腫瘤新發(fā)病例的13%，死亡病例則占到所有腫瘤死亡病例的18%[2]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最為常見的組織類型，占到所有類型肺癌的80%-85%[1]，其中70%NSCLC病例為腺癌或鱗癌[3]。中國是肺癌高發(fā)國家，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居世界首位[4]，且發(fā)病率逐年上升，肺癌的防治工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切的聯(lián)系，一方面免疫系統(tǒng)能夠通過多種免疫效應(yīng)機制殺傷或清除腫瘤細胞，另一方面腫瘤細胞也能夠通過多種免疫逃逸機制抵抗或避免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷或清楚。在腫瘤免疫中，免疫檢查點分子（immune checkpoint）是腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究中的熱點問題。T淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是機體抗腫瘤免疫的中心環(huán)節(jié)，T淋巴細胞作用的強度和效應(yīng)始終處于多種共刺激信號和共抑制信號的精確調(diào)控下，參與T淋巴細胞共抑制信號的分子，稱之為免疫檢查點分子，如細胞毒性T細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）、細胞程序性死亡分子1（programmed death 1, PD-1）及其配體（programmed death 1 ligand, PD-L1）等[5]。免疫檢查點對于實現(xiàn)免疫反應(yīng)的精準(zhǔn)控制具有關(guān)鍵作用，腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫檢查點的異?；罨悄[瘤細胞免疫逃逸的重要途徑之一。這也為腫瘤的靶向治療提供了新的靶點，CTLA-4、PD-1/PD-L1被認(rèn)為是目前最有效的治療靶點[6]。

在NSCLC中，腫瘤驅(qū)動基因（tumor driver gene）突變引起的信號通路異常激活是腫瘤發(fā)生的重要機制，已有研究表明腫瘤驅(qū)動基因突變與PD-1/PD-L1信號的異常激活存在著密切的聯(lián)系，從而介導(dǎo)了NSCLC的發(fā)生與發(fā)展。同時也提示了針對腫瘤驅(qū)動基因靶向治療與PD-1/PD-L1阻斷治療聯(lián)合應(yīng)用的可能。

1 肺癌驅(qū)動基因

基于腫瘤基因水平的研究，已經(jīng)確定了許多與腫瘤誘發(fā)和維持惡性腫瘤的分子改變，稱為腫瘤驅(qū)動基因。腫瘤驅(qū)動基因改變是NSCLC發(fā)病的重要機制之一，尤其是在肺腺癌中，功能性驅(qū)動基因的突變率約為60%，其中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、鼠類肉瘤病毒癌基因（Kirsten rate sarcoma viral oncogene homolog, KRAS）以及棘皮微管樣蛋白4（echinoderm microtubule associated protein-like 4, EML4）-間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）融合基因（EML4-ALK）最為常見，占35%-40%[7]。EGFR是肺腺癌中最重要的驅(qū)動基因，EGFR為酪氨酸跨膜受體，在NSCLC中外顯子19缺失突變（delE746-A750）及858位亮氨酸替代精氨酸突變（L858R）是最常見的突變方式[8]。EGFR突變后能夠?qū)е缕渥粤姿峄?，激活酪氨酸激酶，并進一步激活RAS/RAF/MEK/MAPK通路、PI3K/AKT/mTOR通路，參與腫瘤細胞的增殖、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成[9]。KRAS基因?qū)儆赗AS基因家族，為EGFR信號下游重要的調(diào)節(jié)位點，參與細胞增殖與分化的調(diào)節(jié)，其主要突變位點發(fā)生在12、13和61密碼子，其中密碼子12突變占到90%[10]，突變使得在缺乏生長因子信號的條件下也可激活RAS-GTP酶，使得細胞獲得持續(xù)增殖的能力。EML4-ALK融合基因是由2號染色體EML4在內(nèi)含子13位置處斷裂與ALK基因19內(nèi)含子位置連接形成，EML4-ALK融合基因能夠異常激活下游MAPK、PI3K、STAT等信號通路，介導(dǎo)細胞增殖與侵襲，并且參與細胞凋亡的抑制[11]。

基于驅(qū)動基因，特別是EGFR信號通路的靶向治療藥物已經(jīng)逐漸成為NSCLC治療的趨勢，吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）等表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFRTKI）已經(jīng)在NSCLC晚期患者中得到成功應(yīng)用，使得患者的無疾病進展生存期（progression-free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）均得到顯著延長[12,13]。

2 PD-1/PD-L1通路

PD-1屬于免疫球蛋白B7-CD28家族，為I型跨膜蛋白[14]，主要表達于活化的免疫細胞，包括T細胞、B細胞、NKT（natural killer T）細胞、樹突狀細胞、單核-巨噬細胞等[15]，由于PD-1分子具有免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM）、免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM），為免疫抑制性受體，T細胞PD-1表達是T細胞應(yīng)答疲勞的重要標(biāo)志[14]。

PD-L1（B7-H1）為PD-1的主要配體，主要表達于T細胞、B細胞、樹突狀細胞、肥大細胞等造血細胞來源細胞[16]，在內(nèi)皮細胞和多種上皮細胞中也有表達[17]。而在NSCLC、黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中，PD-L1也有高表達，提示這可能是腫瘤免疫逃逸的重要機制。研究表明，PD-1與PD-L1的相互作用對CD4+及CD8+T細胞的增殖分化起到抑制作用，降低多種免疫因子的表達，并促進活化的效應(yīng)細胞毒性T細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）凋亡，介導(dǎo)腫瘤細胞逃避CTL的殺傷[18]。除此之外，PD-L1還能夠增強調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells, Tregs）的免疫抑制作用[19]。這表明，PD-1/PD-L1通路通過抑制腫瘤局部微環(huán)境的免疫效應(yīng)，參與腫瘤的免疫逃逸，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

在NSCLC病例中，19.63%-65.38%的病例發(fā)現(xiàn)有PD-L1的高表達[20-24]，其中女性患者、非吸煙病例中PD-L1高表達更為明顯，并且腺癌病例中PD-L1表達顯著高于鱗癌[20]，這提示腫瘤發(fā)生機制的差異與PD-L1的表達相關(guān)。PD-L1的高表達提示患者預(yù)后較差[20,25]。這都表明PD-1/PD-L1通路是NSCLC發(fā)生發(fā)展中的一個關(guān)鍵分子途徑。目前針對PD-1/PD-L1通路的免疫靶向藥物在NSCLC治療中已經(jīng)表現(xiàn)出令人驚喜的效果，納武單抗（Nivolumab, Opdivo）、派姆單抗（Pembrolizumab,Keytruda）已經(jīng)相繼被美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）相繼批準(zhǔn)用于NSCLC的治療。在多項臨床試驗中，PD-1免疫靶向治療患者的緩解率（overall response rate, ORR）、5年生存率、OS均有了顯著的提高，取得了優(yōu)于傳統(tǒng)化療藥物的治療效果[26-28]。需要引起注意的是腫瘤PD-L1水平可能是免疫靶向治療療效的一個重要影響因素，PD-L1陽性患者的ORR顯著高于PD-L1陰性患者[27,28]。這均提示PD-1/PD-L1通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，但PD-1/PD-L1通路在腫瘤組織中激活與調(diào)控機制尚未完全闡明，腫瘤驅(qū)動基因在PD-1/PD-L1的調(diào)控中作用機制已成為前沿?zé)狳c。

3 PD-L1表達與肺癌驅(qū)動基因EGFR的關(guān)系及調(diào)控

EGFR基因是NSCLC中最重要的驅(qū)動基因之一。目前已經(jīng)有研究反映了EGFR與PD-L1表達之間存在一定的聯(lián)系。在亞洲NSCLC患者中攜帶有EGFR突變的比例占到47.9%[29]，并且在女性、非吸煙及腺癌病例中，EGFR突變較高[30]，這與PD-L1的表達模式相一致。Azuma等[20]對手術(shù)切除的NSCLC腫瘤樣本進行的分析表明EGFR突變與PD-L1表達之間存在著相互關(guān)系。在人NSCLC細胞系中，攜帶有EGFR突變的細胞中PD-L1的表達要顯著高于EGFR野生型細胞[6,20]。Akbay等[24]發(fā)現(xiàn)激活EGFR通路，PD-L1的表達上調(diào)，并通過PD-1/PD-L1通路的激活介導(dǎo)了腫瘤的免疫逃逸。研究[6,20,24,31]還發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI能夠抑制TKI敏感細胞系中EGFR信號的活化，降低PD-L1的表達，但在EGFR-TKI抗性的NSCLC細胞系中，EGFR-TKI則不能夠影響PD-L1的表達水平。但也有研究[31]卻得出了相反的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)在EGFR-TKI抗性細胞系中，PD-L1表達水平要高于EGFR-TKI敏感細胞系，EGFR-TKI同樣能夠降低抗性細胞系中PD-L1的表達。這都表明PD-L1表達與EGFR信號通路有著密切的聯(lián)系，PD-L1的表達受到EGFR信號的調(diào)控。Chen等[6]認(rèn)為，EGFR對PD-L1的調(diào)控是通過ERK1/2/c-Jun通路實現(xiàn)的，EGFR基因突變會使得EGFR磷酸化水平提高，激活EGFR通路，磷酸化ERK及c-Jun，從而上調(diào)PD-L1的表達水平，而AKT通路在這個過程中并不發(fā)揮作用。但也有研究[32]表明，PI3K-AKT通路與MEK-ERK通路均參與了EGFR對PD-L1的調(diào)控，利用PI3K-AKT通路及MEK-ERK通路的特異性阻斷劑，均能夠觀察到PD-L1表達水平的顯著下調(diào)。NF-κB被認(rèn)為是PD-L1在單核細胞中表達重要調(diào)控因子，它能夠直接結(jié)合于PD-L1的啟動子，直接參與PD-L1表達調(diào)控[33]，Lin等[31]則發(fā)現(xiàn)在NSCLC細胞中，NF-κB仍在PD-L1的調(diào)控中發(fā)揮作用，EGFR-TKI能夠通過抑制NSCLC細胞中NF-κB的表達，當(dāng)NF-κB表達下調(diào)后，PD-L1的表達水平也隨之下調(diào)，這提示EGFR上游信號激活后，NF-κB 可能作為直接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件參與了PD-L1表達的調(diào)控。

EGFR與PD-L1之間的關(guān)系還存在有很大的爭議，也有很多研究表明，PD-L1的表達與EGFR通路并無相關(guān)性，Zhang等[34]檢測了143份手術(shù)切除的肺癌組織標(biāo)本，在EGFR突變型肺癌組織中發(fā)現(xiàn)PD-L1和PD-L2表達陽性與陰性的例數(shù)相比并無顯著性差距。因此還需要更加深入的研究，以明確EGFR同PD-L1表達之間的關(guān)系及具體機制（圖1）。

在EGFR-TKI的治療過程中，EGFR-TKI耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重限制了患者在EGFR-TKI靶向治療中的收益。由于EGFR突變和PD-L1表達之前可能存在著一定相互關(guān)系，EGFR-TKI與PD-1單抗的聯(lián)合應(yīng)用，可能對提高患者治療效果提供了新思路。2014年第50屆美國臨床腫瘤學(xué)會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）年會上，公布了Nivolumab聯(lián)合厄洛替尼治療EGFR-TKI繼發(fā)耐藥NSCLC患者的臨床試驗，結(jié)果顯示Nivolumab聯(lián)合厄洛替尼可帶來持續(xù)性臨床獲益，其ORR為19%。這也提示PD-1單抗與EGFR-TKI聯(lián)合治療可顯著提高NSCLC患者的治療效果（圖2）。

4 PD-L1表達與肺癌驅(qū)動基因EML4-ALK間的關(guān)系及調(diào)控

EML4-ALK也是NSCLC重要的驅(qū)動基因，中國NSCLC患者中的陽性率為3%-11%[35-37]，多見于年輕、不吸煙或少量吸煙患者及EFGR和KRAS陰性的肺腺癌患者[38]。有研究[20]發(fā)現(xiàn)，EML4-ALK陽性細胞的PD-L1表達水平顯著高于EML4-ALK陰性的細胞，并且EML4-ALK融合蛋白的表達能夠上調(diào)PD-L1的表達，抑制ALK的活性或敲除EML4-ALK后，同樣能夠降低PD-L1的表達。這表明PD-L1的表達受到EML4-ALK融合蛋白的調(diào)控。進一步的研究表明，MEK-ERK及PI3K-AKT通路參與了EML4-ALK調(diào)控PD-L1表達的過程，這一信號通路與EGFR的調(diào)控途徑相似，表明EML4-ALK與EGFR這兩個不同的癌基因可能共享相同的調(diào)控通路來調(diào)控PD-L1的表達。

圖 1 PD-L1表達與EGFR信號通路關(guān)系Fig 1 The relationship between PD-L1 expression and EGFR pathway. NSCLC: non-small cell lung cancer; EGFR: epidermal growth factor receptor; PD-L1: programmed death 1 ligand.

圖 2 NSCLC靶向治療與PD-1/PD-L1免疫治療Fig 2 Targeted therapy and PD-1/PD-L1 targeted immune therapy in NSCLC. PD-1: programmed death 1.

5 PD-L1表達與肺癌驅(qū)動基因KRAS間的關(guān)系及調(diào)控

15%-20%的NSCLC患者攜帶有KRAS基因突變，而且常發(fā)生在吸煙的肺腺癌患者中[37]。KRAS與PD-L1表達之間的關(guān)系目前研究較少，仍存在一定的爭議。D'Incecco等[39]的研究觀察到，PD-L1的表達與KRAS基因突變存在顯著的相關(guān)性（P=0.006）。但也有很多研究持有不同的觀點，Calles等[40]研究了KRAS突變的NSCLC患者中PD-L1的表達水平，發(fā)現(xiàn)在KRAS突變的NSCLC患者中，有24%表現(xiàn)為PD-L1陽性，KRAS的主要突變類型KRAS G12C、KRAS G12D、KRAS G12V、KRAS G13X及KRAS Q61H均與PD-L1的表達水平無顯著相關(guān)性。KRAS信號可能不參與PD-L1表達的調(diào)控[24,36]。

6 展望

PD-1/PD-L1信號通路與肺癌驅(qū)動基因存在著一定的相互作用，特別是在EGFR可能通過PI3K-AKT通路與MEK-ERK通路上調(diào)PD-L1的表達，從而介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。肺癌驅(qū)動基因與免疫檢查點分子間的相互作用對于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有重要的意義。但兩者間的調(diào)控機制尚未完全闡明，EGFR、KRAS突變與PD-L1表達水平間的關(guān)系仍存在著爭議，表明肺癌中PD-1/PD-L1的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，可能涉及到多個驅(qū)動基因及多條信號通路，需要進一步的研究和探討。但目前，基于PD-1/PD-L1的免疫靶向治療已經(jīng)在NSCLC的治療中取得了良好的效果，對解決EGFR-TKI耐藥性的制約提供了新的方法[41]，EGFR-TKI聯(lián)合阻斷PD-1/PD-L1的治療模式為提高肺癌患者長期生存帶來了新的希望。隨著對PD-1/PD-L1及肺癌驅(qū)動基因研究的深入，將豐富我們對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸機制的認(rèn)識，為腫瘤的精準(zhǔn)治療提供新的方向。