張悅楊 劉峰

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731)

HPLC法測(cè)定利培酮片有關(guān)物質(zhì)的優(yōu)化

張悅楊 劉峰

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 611731)

目的：建立HPLC梯度洗脫法測(cè)定利培酮片的有關(guān)物質(zhì)。方法：采用Sepax GP-C18(4.6×100 mm，3 μm)為色譜柱；以流動(dòng)相A：水-乙腈-三氟乙酸(80:19.5:0.1)(用氨水調(diào)節(jié)pH值至3.0)與流動(dòng)相B：水-甲醇-三氟乙酸(61:39:0.1)(用氨水調(diào)節(jié)pH值至3.0)，進(jìn)行梯度洗脫；柱溫35℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長275 nm。結(jié)果：利培酮在0.5088 μg·ml-1～1017.6 μg·ml-1濃度范圍內(nèi)與相應(yīng)峰面積線性關(guān)系良好；檢測(cè)限(S/N=3)為0.5088 ng·mL-1。結(jié)論：優(yōu)化后的方法更有利于利培酮片雜質(zhì)的檢出。

利培酮片；高效液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)；梯度洗脫

利培酮片為非典型抗精神病藥，比利時(shí)楊森制藥公司于1984年研發(fā)，1997年在我國完成進(jìn)口注冊(cè)申請(qǐng)并上市，2002年完成仿制藥申請(qǐng)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床。主要用于治療急性和慢性精神分裂癥以及其他各種伴精神病性癥狀的疾病，其不良反應(yīng)主要為錐體外系癥狀，如心動(dòng)過速、肌緊張、流涎、運(yùn)動(dòng)遲緩等。利培酮原料藥純度較高，雜質(zhì)檢出率低，但制劑中雜質(zhì)均有不同程度增加。利培酮片在ChP2015[1]、USP36版[2]與日本藥典16版[3]均已有收載，但色譜條件及限度設(shè)置有較大差異。本研究參考USP36版，優(yōu)化了有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的色譜條件，為提高利培酮片的雜質(zhì)檢查方法和統(tǒng)一限度建立了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：Waters e2695系列高效液相色譜儀，Waters 2489 紫外檢測(cè)器，Waters 2998 二極管陣列檢測(cè)器；試劑試藥：利培酮系統(tǒng)適用性對(duì)照品(來源：EP，批號(hào)：003AO8)，利培酮對(duì)照品(來源：中檢所，批號(hào)：100570-201102，純度：99.9%)，乙腈、甲醇為色譜純；三氟乙酸、氨水均為分析純；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱Sepax GP-C18(4.6×100 mm，3 μm)及Thermo ODS HYPERSIL(4.6×100 mm，3 μm)；柱溫為35℃；流速為1.0 mL·min-1；流動(dòng)相A為水-乙腈-三氟乙酸(80:19.5:0.1)(用氨水調(diào)節(jié)pH值至3.0)，流動(dòng)相B為水-甲醇-三氟乙酸(61:39:0.1)(用氨水調(diào)節(jié)pH值至3.0)，梯度洗脫(0～8 min、100%A，8～16 min、100%～0%A，16～24 min、0%A，24～30 min、0%～100%A，30～40 min、100%A)；檢測(cè)波長275 nm；進(jìn)樣體積20 μL。

1.2.2 溶液的配制

系統(tǒng)適用性溶液的配制：精密稱取利培酮系統(tǒng)適用性對(duì)照品約10 mg，置10 ml量瓶中，加1.54%醋酸銨溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至6.5)-水-甲醇(1:9:10)使溶解并稀釋至刻度、搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液(1)；另精密稱取利培酮對(duì)照品約10 mg，置100 ml量瓶中，加稀氫氧化鈉溶液(取水適量，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5)10 ml，置90℃烘箱中放置24 h，冷卻至室溫，加稀過氧化氫溶液(取30%過氧化氫溶液1 ml，加水稀釋至500 ml)10 ml，置90℃烘箱中放置2 h，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，作為系統(tǒng)適用性溶液(2)；分別精密量取系統(tǒng)適用性溶液(1)和系統(tǒng)適用性溶液(2)各1 ml，混勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

供試品溶液的配制：取本品的細(xì)粉適量(約相當(dāng)于利培酮2 mg)，置10 ml量瓶中，加水2 ml，置60℃水浴中振搖30 min，放冷，加6 ml甲醇，超聲20 min使利培酮溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；對(duì)照溶液的配制：精密量取供試品溶液1 ml，置100 ml量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；空白輔料溶液的配制：稱取適量空白混合輔料，按供試液配制法同法制備。

2 結(jié)果

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20 μl注入液相色譜儀，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，出峰順序?yàn)橐来螢殡p環(huán)利培酮(相對(duì)保留時(shí)間為0.75)，利培酮(相對(duì)保留時(shí)間為1.0)，反式-N-氧化利培酮(相對(duì)保留時(shí)間為1.23)與順式-N-氧化利培酮(相對(duì)保留時(shí)間為1.48)，反式-N-氧化利培酮、順式-N-氧化利培酮兩峰的分離度應(yīng)大于1.2。再分別精密量取流動(dòng)相、空白輔料溶液和供試品溶液(樣品批號(hào)06-131001)各 20 μL，在“1.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，利培酮與雜質(zhì)峰之間分離良好，空白輔料對(duì)測(cè)定無干擾(見圖1和圖2)。另取5 份供試液，第1份沸水浴中破壞10 h，作為熱解樣品；第2份樣品強(qiáng)紫外燈(UV254 nm)破壞48 h，作為光降解樣品；第3份樣品加3 mol·L-1鹽酸溶液3 ml，置沸水浴中加熱破壞2 h，放冷，用3 mol· L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，作為酸解樣品；第4份樣品加3 mol· L-1NaOH溶液3ml，置沸水浴中加熱破壞2 h，放冷，用3 mol·L-1鹽酸溶液調(diào)pH值至近中性，作為堿解樣品；第5份樣品加30%雙氧水0.5 ml，70℃水浴中加熱破壞1 min，作為氧化降解樣品。按“1.2.1”項(xiàng)方法測(cè)定上述各降解樣品，記錄色譜圖。結(jié)果表明本品經(jīng)熱、光、酸、堿、氧化破壞后的雜質(zhì)峰能夠與主峰有效分離，該色譜條件滿足利培酮片有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的專屬性。

2.2 線性關(guān)系、檢出限試驗(yàn)

精密稱取利培酮對(duì)照品約20 mg，用80%甲醇溶解并稀釋成0.5、1、10、50、100、150、200、500、800、1000 μg·mL-1的濃度，進(jìn)樣20 μL，以利培酮峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸， 得方程Y=2.8654E+07X-2.5923E+04，R =1.0000。結(jié)果表明本品在0.5088 μg·mL-1～1017.6 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。精密稱取利培酮對(duì)照品適量，加80%甲醇溶解并稀釋制成0.02544 μg·mL-1的溶液，進(jìn)樣20μl分析，S/N約為3.1611，計(jì)算最低檢測(cè)限為0.5088 ng，方法檢出限能夠滿足有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)要求。

圖1 空白輔料色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 檢出限色譜圖

2.3 穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、15 h、18 h測(cè)定，結(jié)果雜質(zhì)數(shù)量均為2，單個(gè)雜質(zhì)含量在0.13%～0.14%范圍內(nèi)，雜質(zhì)總量在0.14%～0.16%范圍內(nèi)，表明供試液在室溫下放置18 h是穩(wěn)定的；取利培酮片(批號(hào)06-131001)細(xì)粉適量，按1.2.2方法配制6份供試液，依法測(cè)定，結(jié)果雜質(zhì)數(shù)量均為2，單個(gè)雜質(zhì)含量在0.11%～0.12%范圍內(nèi)，雜質(zhì)總量在0.13%～0.14%范圍內(nèi)，表明本法重復(fù)性良好。

2.4 耐用性試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分別選取了Sepax GP-C18色譜柱(4.6×100 mm，3 μm)、Thermo ODS HYPERSIL色譜柱(4.6×100 mm，3 μm)按上述方法試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用Thermo ODS HYPERSIL色譜柱，各雜質(zhì)峰及主峰均不出峰，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱選擇性高，推薦使用Sepax GP-C18(4.6×100 mm，3 μm)或性能相當(dāng)?shù)纳V柱。

2.5 樣品的測(cè)定

取一家企業(yè)共9批利培酮片，按“1.2.1～2”項(xiàng)及該企業(yè)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定樣品中的有關(guān)物質(zhì)，見表1。

表1 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，優(yōu)化后有關(guān)物質(zhì)方法能夠檢出更多的雜質(zhì)量及雜質(zhì)個(gè)數(shù)。

3 討論

利培酮原料純度較高，雜質(zhì)含量較少，但利培酮片中的雜質(zhì)明顯多于其原料藥中的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加，未見雜質(zhì)有明顯增加的趨勢(shì)，說明雜質(zhì)主要應(yīng)由制劑生產(chǎn)過程中引入，有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果能夠反映出生產(chǎn)過程可能出現(xiàn)的問題，應(yīng)對(duì)本品的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的控制。

我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[4]中均采用HPLC法對(duì)本品有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，限度較為寬泛，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中主成分出峰時(shí)間較早，多在5～8 min，輔料峰較多，這種情況下易干擾雜質(zhì)的測(cè)定，不利于雜質(zhì)檢出，且原研企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行考察。本品藥理活性較強(qiáng)，不良反應(yīng)頻發(fā)，存在較高安全隱患，有關(guān)雜質(zhì)的控制尤為重要，美國藥典(USP36)與歐洲藥典(EP7.0)[5]均對(duì)利培酮原料藥與利培酮片中特定雜質(zhì)及總雜有嚴(yán)格限定，其中USP36原料藥收載、控制了5種特定雜質(zhì)，均不得過0.2%；EP7.0原料藥收載12種特定雜質(zhì)，單獨(dú)控制了其中6種；USP36利培酮片3種特定雜質(zhì)，單獨(dú)控制其中2種。根據(jù)文獻(xiàn)資料原研企業(yè)根據(jù)其合成路線、生產(chǎn)工藝以及穩(wěn)定性考察的結(jié)果，利培酮原料藥中可能的引入雜質(zhì)及降解產(chǎn)物有 9 種，利培酮片可能的降解產(chǎn)物有 5 種(不同于原料藥)。

采用USP36中的色譜條件檢測(cè)，主峰出峰時(shí)間快，色譜柱柱壓較高，且系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)色譜峰之間未達(dá)到有效分離，通過對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，延長了主峰出峰時(shí)間，已知雜質(zhì)得到更好的分離，提高了有關(guān)物質(zhì)的檢出量。

1 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2015年版 (二部)[S].2015, 493-494.

2 U.S.Pharmacopeia 36[S].5065-5067.

3 The Japanese Pharmacopoeia XVI[S].1354-1355.

4 顏曉丹,高明,蔡振華,等.色譜技術(shù)分析利培酮含量及有關(guān)物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2012, l27(3):321-322.

5 European Pharmacopoeia[S].2861-2863.

6 王明躍,葉曉林. HPLC法同時(shí)測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、鹽酸麻黃堿和維生素C的含量[J].四川生理科學(xué), 2013, 35(2): 65-67.

7 魏瑩,陳珍,馬雪,等. HPLC法比較心臟釆血和頸總動(dòng)脈釆血對(duì)家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響[J].四川生理科學(xué), 2016, 38(1): 18-20.

Optimization of determination of the related substances in Resperidone tablets by HPLC

Zhang Yue-yang, Liu Feng

(Sichuan Institute for Food and Drug Control, Sichuan Chengdu 611731)

Objective：To optimize an HPLC method for the determination of the related substances in Resperidone tablets．Methods: Analysis was carried out on a Sepax GP-C18(4.6×100 mm，3 μm); the column temperature was 35℃, the flow rate was 1.0 mL·min-1, the mobile phase A is water-methanol-TFA (89:19.5:0.1) (adding ammonia to adjust the pH to3.0), the mobile phase B is water-methanol-TFA (61:39:0.1)(adding ammonia to adjust the pH to3.0), the injection volume was 20 μL, and the detection wave length was 275 nm. Results: The linear ranges of Resperidone were 0.5088 μg·ml-1～1017.6 μg·ml-1, respectively. The limits of detection (S/N=3) was 0.5088 ng·mL-1. Conclusion: The optimized method is more propitious to detect the related substances in Resperidone tablets, and control the known impurities.

Resperidone tablets; HPLC; Related substance; Gradient elution

張悅楊，女，主管藥師，主要從事藥物分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Email：16055482@qq.com。

2017-5-22)