唐玉紅 周華 周黎明 丁延鋒 HD Schultz

(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生理教研室，四川 成都 610041；2.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理教研室，四川 成都 610041；3.美國內布拉斯加州立大學醫(yī)學中心細胞與整合生理系，內布拉斯加州 奧馬哈 68198-5850)

論 著

外周化學感受性反射在慢性心力衰竭中的作用及其機制探討*

唐玉紅1△周華1周黎明2丁延鋒3HD Schultz3

(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院生理教研室，四川 成都 610041；2.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理教研室，四川 成都 610041；3.美國內布拉斯加州立大學醫(yī)學中心細胞與整合生理系，內布拉斯加州 奧馬哈 68198-5850)

目的：探討外周化學感受性反射在缺血性心臟病所致慢性心力衰竭中的作用及其機制。方法：采用結扎SD大鼠左冠狀動脈前降支制備慢性心力衰竭(Chronic heart failure，CHF)模型；測定清醒大鼠的每分肺通氣量(Minute ventilation，VE)作為衡量外周化學感受性反射的指標；放射免疫技術測定頸動脈體(Carotid body，CB)血管緊張素II(Angiotensin II，Ang II)水平；并采用Western blot方法檢測 CB組織Ang II 1型受體(Angiotensin II receptor subtype 1 receptor，AT1R)和血管緊張素轉化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的蛋白表達。結果：8周后模型組大鼠形態(tài)學和血流動力學指標均達到CHF動物模型標準，CHF模型制備成功。清醒CHF大鼠在常氧和不同程度缺氧狀態(tài)下，VE均高于假手術組(P<0.05)。放射免疫實驗結果顯示，CHF組CB組織AngII水平明顯高于假手術組(P<0.05)；Western blot結果顯示，與假手術組相比，CHF組CB組織AT1R和ACE的蛋白表達顯著增強(P<0.05)。結論：冠脈結扎的CHF大鼠對缺氧刺激引起的外周化學感受性反射增強，可能促進了交感神經(jīng)活動的過度激活。升高的Ang II可能通過AT1R參與了CB化學感受性反射增強。

慢性心力衰竭；外周化學感受性反射；頸動脈體；血管緊張素II；血管緊張素II1型受體；缺氧

心力衰竭，簡稱心衰(Chronic heart failure，CHF)是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，也是導致心血管疾病死亡的主要原因。隨著人口老齡化的加速、冠心病和高血壓發(fā)病率的上升，冠狀動脈疾病所致缺血性心臟病成為引起心衰最常見的病因[1-3]。探討缺血性心臟病心衰的深層次病理生理機制，進而發(fā)掘治療新策略，有著極其重大的理論和實際意義。

大量研究證實交感神經(jīng)活動(Sympathetic nerve activity，SNA)增強是慢性心衰的特征。持續(xù)增強的SNA增加了心臟的前、后負荷，最終導致心肌毒性和細胞凋亡，是加速病情惡化并使患者存活期縮短的重要因素[4-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在CHF中造成交感功能紊亂涉及多種因素，其機制非常復雜。

近年來，在臨床病人和CHF動物模型都觀察到化學感受性反射(Chemoreceptive reflex)參與了CHF中的交感功能紊亂[10-11]。前期研究表明，起搏方式誘導的心衰家兔，在清醒狀態(tài)下對外周化學感受性反射(Peripheral chemoreceptive reflex)的敏感性增強，并對交感神經(jīng)的過度興奮起到重要作用；升高的Ang II對CB的作用介導了這一效應[12-14]。 然而，關于外周化學感受性反射在CHF中的作用，對臨床病人的研究結果不盡相同，至今尚無定論[15]。

因此，本實驗以冠脈結扎誘導的CHF大鼠為研究對象，以每分肺通氣量為衡量外周化學感受性反射的指標， 并結合Western blot方法和放射免疫測定技術，觀察在缺血性心肌病性心衰過程中，外周化學感受性反射是否增強及AngII在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SD雄性大鼠共52只，220-280 g ，由Sasco Breeding Laboratories (Omaha，NE，USA)提供，實驗方案得到內布拉斯加大學醫(yī)學中心動物護理和使用委員會批準，飼養(yǎng)和護理符合美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物護理和使用指南》。

1.1.2 儀器

PowerLab16S生物信號采集和處理系統(tǒng)(AD Instruments Inc, Australia)；出口管與分壓傳感器 MP-45(Validyne Engineering，Northridge，CA，USA)；SigmaScan Pro軟件(Aspire Software International，USA)；DSI Dataquest PA C40血壓遙測裝置(Data Science International，USA)；Wizard 1470自動伽瑪計數(shù)儀(PerkinElmer，CT，USA)等。

1.1.3 試劑

羊抗大鼠AT1 抗體(SC-31181，Santa Cruz，USA)；羊抗大鼠ACE抗體(SC-12187，Santa Cruz，USA)；小鼠抗大鼠TH抗體(Sigma-Aldrich Chemical Co.，St Louis，MO，USA)；驢抗羊抗體(Invitrogen Alexa Fluro 488，Molecular Probes，USA)；驢抗小鼠抗體(Invitrogen Alexa Fluro 568，Molecular Probes，USA)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(Protein assay kit (Pierce，USA)；01-RK-A22 AngII125I 放射免疫試劑盒(ALPCO Diagnostics，USA)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠冠脈結扎心衰模型的制備

雄性SD大鼠，3%異氟醚麻醉，于左冠狀動脈起始點下2 mm(前降支)處，用穿有6-0號絲線的不銹鋼彎針穿過，結扎，造成心肌缺血。假手術組(Sham)以完全相同的方式操作，但不結扎冠狀動脈。術后8周超聲心動圖評估所有大鼠的心臟功能。與Sham組大鼠正常心臟功能相比，冠脈結扎大鼠的射血分數(shù)(Ejection fraction，EF)和左室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S)降低>30%時，計入心衰模型組。并且在實驗結束后和處死動物前，進一步測量左室舒張期末壓(Left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)等指標；處死動物，測量心梗面積和全左心室壁面積；當LVEDP>15 mmHg及心梗面積占左室壁面積之比>30%的冠脈結扎大鼠，最終被確定獲得CHF。

1.2.2 大鼠在清醒狀態(tài)下外周化學感受性反射活動的記錄

將大鼠置于一自制的有機玻璃盒里，通入氣體的導管經(jīng)從盒兩側小孔出入，不同濃度的混合氣體流過有機玻璃盒，使血液氣體濃度改變。出口管與分壓傳感器MP-45相連，后者通過放大器連于PowerLab 16S生物信號采集和處理系統(tǒng)。記錄大鼠清醒狀態(tài)下潮氣量(Tidal volume，VT)和呼吸頻率(Respiratory rate，RR)以計算VE。依次給予大鼠21%O2(常氧)、15%O2(輕度缺氧)和10%O2(重度缺氧)，觀察上述指標的改變，同時經(jīng)放置于股動脈的血壓遙測裝置監(jiān)測動脈血壓和心率。

1.2.3 CB組織Ang II濃度的測定

將假手術組與CHF組大鼠CB組織勻漿、萃取和重建，每管樣品用Wizard 1470自動伽瑪計數(shù)儀計數(shù)1 min，根據(jù)標準曲線得到AngII濃度。采用放射免疫技術測定CB組織Ang II的濃度。

1.2.4 CB組織AT1R和ACE的表達

迅速取下每只大鼠兩側的CB，立即放入干冰，并儲存于-80°C備用。提取CB組織中的蛋白質，采用常規(guī)Western blot方法，檢測AT1R和ACE在CB組織的表達。

1.3 統(tǒng)計分析

各組數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，用SigmaStat統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行配對t檢驗，以P<0.05為有顯著性差異。分別以AT1R和ACE蛋白條帶的灰度值與內參GAPDH條帶的灰度值的比值作為評價AT1R和ACE蛋白質表達水平的指標。

2 結果

2.1 大鼠冠脈結扎心衰模型的制備

26只假手術組大鼠動物均存活，冠脈結扎組存活率約為68%。假手術組大鼠心臟形態(tài)正常，沒有可見的心肌損傷，見圖1A；模型組大鼠心臟增大，左室可見明顯的梗死區(qū)域，梗死區(qū)心肌為白色瘢痕組織代替，左室腔擴大，左室壁增厚，見圖1B，模型組心梗面積占左室壁面積之比為43.1%±3.9。與假手術組相比，模型組大鼠的心臟重量與體重之比增加，左室舒張期末壓(Left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)明顯升高，而射血分數(shù)(Ejection fraction，EF)和左室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S)顯著降低，見表1。

A B圖1 假手術組(A)和CHF大鼠(B)左心室腔照片 (黃色箭頭指示梗死區(qū))

注：與假手術組相比，*P<0.05。

LVESD(Left ventricular end-systolic diameter)—左室收縮末期直徑；LVEDD(Left ventricular end-diastolic diameter)—左室舒張末期直徑。

2.2 CHF大鼠在清醒狀態(tài)下外周化學感受性反射活動增強

實驗發(fā)現(xiàn)，在常氧(21%O2)、中度(15%O2)和重度(10%O2)缺氧的狀態(tài)下，CHF組的每分肺通氣量(VE)均高于假手術組(P<0.05)，見表2 。

表2 在不同O2濃度下假手術組和CHF組大鼠的每分肺通氣量(X±SD)

注：與假手術組相比，*P<0.05。

2.3 CHF組CB組織Ang II濃度增高

放射免疫實驗結果顯示，CHF組AngII水平明顯高于假手術組(P<0.05)，見表3。

2.4 CHF大鼠CB組織AT1R和ACE的蛋白表達增強

Western blot結果顯示，與假手術組相比，CHF組CB組織AT1R和ACE的蛋白表達增強(P<0.05)，見圖2和表3。

圖2 假手術組和慢性心衰組大鼠CB組織 AT1R(A)及ACE(B)的表達

組 別例 數(shù)AngII濃度(pg·mg-1)AT1R/GAPDHACE/GAPDH假手術組 20362±363113±025028±002慢性心衰組195144±043?213±023?037±002?

注：與假手術組相比，*P<0.05。

3 討論

本實驗采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支8周制備CHF模型，結果顯示，模型組大鼠心室肥厚，左心室有大于30%的梗死區(qū)域和左心室功能明顯減弱，達到心衰動物模型的組織學和功能學指標，表明CHF模型制備成功。

與快速起搏心衰模型相比，大鼠冠脈結扎的心衰模型能更好地模擬臨床缺血性心肌病性CHF的病理生理過程，并具有成本低廉，可操作性強等優(yōu)點，更適用于缺血性心肌病性心衰的研究[16]。

本實驗以VE為衡量外周化學感受性反射的指標，觀察到冠脈結扎的心衰大鼠對缺氧刺激引起的外周化學反射增強，與前期在家兔心衰模型的研究報道一致[12]，進一步證實了CHF過程中外周化學感受性反射的增強，該現(xiàn)象可能參與了交感神經(jīng)活動的過度激活。而在冠脈結扎誘導的心衰大鼠模型上的這一發(fā)現(xiàn)，則為臨床缺血性心肌病性心衰中SNA增強機制的研究提供了新的路徑。常氧下CHF組VE也高于假手術組，可能的機制是在CHF發(fā)生發(fā)展過程中，由于心臟功能減弱造成的動脈供血供氧不足，引起代償性化學反射增強。

AngII是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的成分之一，由血漿或組織中的ACE水解血管緊張素I而生成；其生理作用幾乎都是激動AT1受體產(chǎn)生的。AngII主要在失血、運動、腎血流量降低時發(fā)揮心血管調控作用[17]。由于Ang II具有改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感功能的作用，被認為是調節(jié)交感傳出最主要的因素。有研究表明在冠脈結扎誘導的心衰大鼠中樞Ang II在交感傳出的增強起到重要作用[13]。在CHF病人和CHF動物模型都觀察到血漿和組織的Ang II 水平增高[14]。前期采用起搏誘導的家兔心衰模型研究也提示CB的Ang II和AT1R增強了外周化學感受器對低氧的敏感性[12]。在本實驗中，CHF大鼠CB組織Ang II的濃度增加及AT1R、ACE的蛋白表達增強，提示CB組織AngII合成增加，并通過AT1受體發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實了CHF過程中外周化學感受性反射活動增強并可能參與交感神經(jīng)活動的過度激活，升高的Ang II可能通過AT1受體參與了CB化學感受性反射增強。該研究為進一步探討缺血性心臟病心衰的病理生理機制及發(fā)掘新的藥物靶點提供了新的實驗依據(jù)。

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Enhanced peripheralchemoreceptive reflex activity and the involved mechanism in conscious rats with chronic heart failure*

Tang Yu-hong1Δ, Zhou Hua1, Zhou Li-ming2, Ding Yan-feng3, HD Schultz3

(1.Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041; 2.Department of Pharmacology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041; 3.Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, Nebraska Omaha 68198-5850)

Objective：To investigate the mechanisms of the peripheral chemoreceptive reflex in chronic heart failure caused by ischemic cardiomyopathy. Methods: CHF was produced by ligating the left anterior descending coronary artery in SD male rats. VE were measured in conscious rats as an indicator of peripheral chemoreceptive reflex. The Ang II levels of CB tissues were measured by radioimmunoassay, and the expression of AT1R and ACE protein in CB tissues were detected by Western blot. Results: CHF model was successfully produced for the morphological and hemodynamic indexes of rats reached the standard of CHF animal model 8 weeks after ligation. The VE in conscious CHF rats under normoxia and hypoxia were higher than that in the sham group (P<0.05). The level of AngII of CB tissues in CHF group was significantly higher than that in the sham group (P<0.05) by radioimmunoassay; Western blot results showed that compared with the sham group, the expressions of AT1R and ACE in CB tissues increased in CHF group (P<0.05). Conclusion: An enhancement of the peripheral chemoreceptive reflex occurs in the conscious rats with ligation-induced CHF and it may contribute to the sympathetic over-activation in the CHF state. Elevated Ang II in CB may be involved in the enhancement of CB chemoreceptive reflex via AT1R.

Chronic heart failure; Peripheral chemoreceptive reflex; Angiotensin II; Angiotensin II 1-type receptor; Carotid body; hypoxia

NIH基金(編號：PO-1 HL 62222)

唐玉紅，女，講師，主要從事神經(jīng)生理學研究，Email：yvonneyht@163.com。

2017-7-17)