譚 嘯，孫玉童，段志鵬，曾慶飛，鄭雪瑩，劉倩倩

(1：河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，河海大學環(huán)境學院，南京 210098)(2：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

不同超聲強度下微囊藻群體沉降及其上浮過程對光照和溫度的響應

譚 嘯1，孫玉童1，段志鵬1，曾慶飛2，鄭雪瑩1，劉倩倩1

(1：河海大學淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，河海大學環(huán)境學院，南京 210098)(2：中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國家重點實驗室，南京 210008)

以太湖微囊藻群體為研究對象，研究低頻超聲作用下，4種超聲強度和不同處理時間對微囊藻群體的抑制效應，試圖得出最優(yōu)超聲參數(shù)，同時探討超聲處理后的微囊藻群體對光照和溫度的響應. 結果表明，當超聲強度為0.0353 W/cm3、處理時間為60 s時，藻細胞沉降量高達80%，且此時藻細胞濃度和葉綠素a濃度均保持不變，表明超聲未破碎藻細胞，細胞內含物不會泄漏污染水質，因此作為最優(yōu)超聲參數(shù). 隨后，對超聲處理后的微囊藻群體在不同光照和溫度條件下進行恢復培養(yǎng)，結果表明光照和溫度均能影響微囊藻群體的浮力恢復，但光照的影響更明顯，當光照度為2000 lx時，藻細胞在培養(yǎng)120 h后漂浮率恢復至對照組水平. 超聲后的藻細胞在較低溫度(≤20℃)下漂浮率無顯著變化，而在較高溫度(25℃)下，培養(yǎng)72 h后漂浮率迅速升高，至120 h能恢復至對照組水平的80%左右. 因此，野外超聲控藻應選擇低光強、低溫的時段，采用間歇式多次處理，抑制微囊藻群體上浮，使其徹底沉降.

微囊藻群體；超聲強度；超聲時間；沉降；漂浮率；光照；溫度；太湖

頻繁發(fā)生的微囊藻水華給飲用水安全、水產養(yǎng)殖、湖泊景觀帶來嚴重危害[1-3]. 人們采用了多種方法控藻[4-5]，近年來，超聲波作為一種環(huán)境友好型控藻技術得到廣泛關注，其原理是超聲波在水中的傳播過程呈現(xiàn)正負聲壓的周期交變形成空化泡并產生“空化效應”，從而對藻細胞產生機械和自由基損傷[6-7]. 其中，機械損傷主要為偽空胞破裂時產生的沖擊波和剪切力損害細胞膜和細胞壁[8-9]；而自由基損傷主要是空化氣泡破裂產生局部高溫高壓環(huán)境(可達5000 K, 100 MPa)，使水分子分解成HO·和H·等自由基氧化藻細胞[7,10].

超聲波控藻效果取決于其作用參數(shù)(頻率、強度和處理時間). 有研究表明低頻超聲波(20～100 kHz)比高頻超聲波除藻效果更好，低頻條件下空化泡有充足的時間在不破裂情況下產生最大的負壓，從而在崩潰時產生更強的沖擊波[11]. 超聲波強度是影響控藻效果的又一重要因素，舒天閣等[12]采用不同超聲強度處理銅綠微囊藻懸液，發(fā)現(xiàn)50 W除藻效率最大，隨著聲強的繼續(xù)增加，除藻效率反而下降. 此外，Rajasekhar等[13]發(fā)現(xiàn)超聲強度小于0.32 W/cm3，長時間(>5 min)處理會增加水體中藻毒素濃度. 因此，適當?shù)某曁幚砟軌蛴行コ寮毎?，同時降低環(huán)境風險和能耗. 許多研究者均發(fā)現(xiàn)采用低頻低強度的超聲控藻，即時去除效果顯著，主要是通過破壞偽空胞，使其失去浮力下沉[5,14-16]. 然而，在適宜的培養(yǎng)條件下被超聲破壞的偽空胞能夠重新恢復. 李蕓[17]觀察超聲后的魚腥藻和微囊藻偽空胞的恢復情況，發(fā)現(xiàn)在溫度和光照適宜時，魚腥藻的偽空胞達到完全恢復需要5 d，而微囊藻只需2 d. Lee等[5]研究光照和曝氣對超聲后藻細胞恢復的影響，發(fā)現(xiàn)光照是主要的影響因素，只有光照充足時藻細胞才能恢復至處理前的狀態(tài). 由于懸浮顆粒物等的存在，會造成湖泊水下光場的垂直分布差異，且隨著水深加大光強度逐漸減弱，除此之外，自然條件下溫度也是變化的. 因此，研究超聲處理后的藻細胞在不同光照和溫度的恢復過程，試圖找出最佳超聲處理時間段，使超聲后的藻細胞徹底不再上浮，能夠顯著提高超聲控藻效果.

本文采集太湖微囊藻群體作為研究對象，選用低頻超聲波，設置不同的超聲強度和時間，篩選最優(yōu)參數(shù)，探討在最優(yōu)參數(shù)處理后藻細胞在不同光照和溫度的光合活性響應及浮力恢復過程，為超聲除藻提供理論支持和參數(shù)借鑒.

1 材料與方法

1.1 藻樣采集

本實驗使用的藻樣取自太湖梅梁灣(31°24′N，120°13′E). 采樣時間為2015年7月3日，采集水下0.5 m處的藻樣，過0.15 mm孔徑的篩網，選取留在篩網上的微囊藻群體，經過鏡檢發(fā)現(xiàn)主要為銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa). 將微囊藻群體按照葉綠素濃度為0.4 mg/L配置藻細胞懸液.

1.2 實驗裝置

水浴式超聲處理裝置(DAS50-GL1, DAS Corp)如圖1所示. 該裝置的頻率為35 kHz，功率范圍為20～40 W. 超聲強度的計算參照標準量熱法，計算公式為：

圖1 超聲裝置示意圖Fig.1 Diagram of the ultrasonic device

(1)

式中，Cwater為水的比熱容(4.18 J/(kg·K))，Mwater為超聲所用的水量(kg)，ΔT/Δt為超聲輻射時間內的水溫變化率(℃/S)，V為藻懸液體積(ml).

在超聲裝置上設置不同的功率水平，通過公式測算超聲強度.

1.3 實驗方法

實驗設置4種超聲強度，分別為0.0096、0.0193、0.0353和0.0433 W/cm3，將配置好的藻細胞懸液置于燒杯中，在上述超聲強度下分別處理5、30、60、300和600 s，同時設定不進行超聲處理的藻懸液為對照組. 隨后，對藻液進行沉降分析、生長與生理分析.

選取上述實驗的最佳超聲參數(shù)處理后的藻液放入滅菌的25 ml 試管中，分別在3種不同光照度(0、200、2000 lx，光周期均為12 h∶12 h，溫度設置為25℃)和不同溫度(15、20、25℃，光照度均為2500 lx，光周期為12 h∶12 h)的培養(yǎng)箱中對藻細胞進行恢復培養(yǎng)120 h，設置未超聲的藻液作為對照組，每隔24 h分別測定細胞漂浮率及光合活性變化.

1.4 分析方法1.4.1 細胞沉降率/漂浮率的計算 取超聲處理后藻液15 ml于25 ml試管中靜置沉降24 h，分層測定葉綠素a濃度. 即取試管上層藻液14 ml測定懸浮藻細胞的葉綠素a濃度(Chl.a懸浮)，底層1 ml測定沉降藻細胞的葉綠素a濃度(Chl.a沉降)，沉降率和漂浮率的計算公式分別為：

沉降率(%)=Chl.a沉降/(Chl.a懸浮+Chl.a沉降)

(2)

漂浮率(%)=Chl.a懸浮/(Chl.a懸浮+Chl.a沉降)

(3)

1.4.2 藻細胞光合活性測定 最大光化學效率(Fv/Fm)是衡量藻細胞光合作用狀況的重要指標，其中，F(xiàn)v=Fm-Fo，F(xiàn)m是經過飽和脈沖高光強后發(fā)出的最大熒光，F(xiàn)o是經過暗適應的藻細胞在低強度測量光條件下發(fā)出的初始熒光. 取藻懸液2 ml，暗適應15 min，采用AquaPen-C AP-C 100葉綠素熒光儀(飽和脈沖光強為3200 μmol (photons) /(m2·s))測定藻細胞葉綠素a熒光，并計算Fv/Fm.

1.4.3 藻細胞濃度測定 將藻液滴在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)，然后換算成待測藻液的細胞濃度.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理、圖形繪制，用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.

2 結果

2.1 超聲強度對微囊藻群體的沉降效果

不同超聲強度下，藻細胞下沉達到最大量的超聲處理時間各不相同. 在0.0096 W/cm3超聲強度下，藻細胞達到最大沉降率的時間為300 s，此時沉降率為76.12%. 在0.0193和0.0353 W/cm3超聲強度下，最佳超聲處理時間是60 s，沉降率分別是75%和79.35%，而0.0433 W/cm3處理組的沉降率達到最大值74.75%的超聲時間是5 s(圖2). 比較各個超聲強度的沉降率大小，可得出最優(yōu)超聲參數(shù)：超聲強度為0.0353 W/cm3，處理時間為60 s.

圖2 不同超聲強度和處理時間的控藻效果(**表示顯著差異，P<0.05；***表示極顯著差異，P<0.01；下同)Fig.2 Comparison of ultrasonic effects under different intensity conditions for different time(** indicates significant difference at P<0.05; *** indicates significant difference at P<0.01, the same below)

本文觀察了最優(yōu)超聲強度下(0.0353 W/cm3)藻細胞的濃度變化(圖3). 當超聲處理時間不超過60 s(最佳處理時間)時，藻細胞濃度無顯著差異(P>0.05). 隨著超聲的繼續(xù)進行，藻細胞濃度顯著降低(P<0.05)，其變化趨勢與懸液中葉綠素a濃度變化一致.Fv/Fm是衡量藻細胞光合作用狀況的重要指標，本研究表明藻細胞光合系統(tǒng)對超聲非常敏感，F(xiàn)v/Fm由初始值0.416降低至0.152，并且在超聲60 s時，藻細胞光合活性下降率最大，達32.6%(圖4).

2.2 光強對超聲后微囊藻上浮的影響

未超聲組藻細胞在無光照下呈現(xiàn)輕微上浮現(xiàn)象，而有光照時，藻細胞有輕微下沉趨勢，但總體差異不顯著(P>0.05)；超聲組藻細胞在光照度為200 lx和2000 lx下，均在培養(yǎng)72 h后漂浮率顯著增加(P<0.05)，培養(yǎng)至120 h，2000 lx光照度下超聲藻細胞能恢復至與對照組無顯著差異，而200 lx和0 lx光照度下超聲處理組與對照組差異顯著(P<0.05). 0 lx光照度下超聲處理組藻細胞漂浮率為15%左右，200 lx光照度下超聲處理組藻細胞的漂浮率恢復至對照組水平的70%. 從光合活性變化來看，在黑暗條件下，對照組藻細胞的Fv/Fm有輕微的減少趨勢，超聲組藻細胞在恢復培養(yǎng)的前48 h最大光合效率均較低，72 h后迅速增大，但是除2000 lx光照度外，超聲組藻細胞Fv/Fm始終低于對照組(P<0.05)(圖5).

2.3 溫度對超聲后微囊藻上浮的影響

比較超聲組和對照組藻細胞在不同溫度下的響應，發(fā)現(xiàn)未超聲處理的藻細胞在15℃培養(yǎng)后下沉(沉降率達20%)，而經25℃恢復培養(yǎng)后的藻細胞有輕微上浮，與恢復培養(yǎng)前相比，漂浮率升高約10%. 在溫度為15℃和20℃條件下，超聲組藻細胞在培養(yǎng)72 h內繼續(xù)沉降，72 h后有輕微恢復，但漂浮率與恢復培養(yǎng)前相比無顯著變化(P>0.05)；在25℃條件下，藻細胞在恢復培養(yǎng)96 h后明顯上浮，120 h后上浮約40%左右. 對照組藻細胞在不同溫度下光合活性波動很小，而超聲組藻細胞Fv/Fm在培養(yǎng)48 h后開始增加，在25℃條件下恢復培養(yǎng)120 h后光合活性接近未超聲的狀態(tài)(圖6).

圖3 藻細胞濃度隨超聲處理時間的變化(超聲強度為0.0353 W/cm3)Fig.3 Changes of cell concentration at different treatment time (Ultrasound intensity=0.0353 W/cm3)

圖4 Fv/Fm隨超聲處理時間的變化(超聲強度為0.0353 W/cm3)Fig.4 Changes of Fv/Fm at different treatment time (Ultrasound intensity=0.0353 W/cm3)

圖5 不同光照度下超聲和未超聲藻細胞恢復培養(yǎng)過程中上浮情況及其光合活性變化Fig.5 Changes of algae floating rate and photosynthetic activity under different light intensity conditions

圖6 不同溫度下超聲和未超聲藻細胞恢復培養(yǎng)過程中上浮情況及其光合活性變化Fig.6 Changes of algae floating rate and photosynthetic activity under different temperature conditions

3 討論

3.1 最優(yōu)超聲強度與處理時間

超聲波除藻的機理研究中，研究對象多是實驗室培養(yǎng)的單細胞微囊藻，而野外微囊藻群體與單細胞相比，微結構、多糖含量和色素組成都較復雜[18]，這可能會造成超聲波對微囊藻群體和單細胞影響的差異. 本文選取太湖的微囊藻群體作為研究對象，發(fā)現(xiàn)在0.0353 W/cm3、60 s超聲參數(shù)下，藻細胞沉降量最大(高達80%)，這與Lee等[5]的研究結果類似. 已有研究[14-16]表明，超聲對野外微囊藻群體的去除效果明顯優(yōu)于室內培養(yǎng)微囊藻(表1)，表明野外微囊藻群體對超聲更敏感. 徐鵬飛等[19]發(fā)現(xiàn)懸液中藻細胞濃度與懸液葉綠素濃度呈良好的線性關系，因此，可用葉綠素濃度間接反映藻細胞數(shù)量. 本研究發(fā)現(xiàn)當超聲處理時間在60 s內，胞內葉綠素a濃度無顯著變化，藻懸液葉綠素濃度變化與0.0353 W/cm3處理組的藻細胞濃度變化趨勢一致，推測此時葉綠素a主要位于細胞內，未發(fā)生細胞內含物溶出. 因此，在0.0353 W/cm3、60 s超聲條件下，藻細胞沒有破碎，而可能是藻細胞內的偽空胞破裂或者群體打散，從而促使藻細胞下沉. Lee等[5]研究發(fā)現(xiàn)，28 kHz、120 W的超聲條件下，3 s的超聲處理就可以使偽空胞破裂，使80%的藻細胞下沉. 此外，藻細胞的光合活性對超聲非常敏感，可能是超聲破壞了類囊體膜上的色素蛋白和電子傳遞體[20-21]. 本研究結果表明低頻、低強度和短時間的超聲波可在不破碎藻細胞導致細胞內含物釋放的情況下使微囊藻下沉，并且顯著損傷微囊藻的光合系統(tǒng)，為水華應急處理提供了環(huán)境安全保障.

表1 低頻、低強度超聲除藻效果比較

3.2 光強與溫度對超聲后藻細胞浮力恢復影響的比較

藍藻浮力調節(jié)存在兩種機制：細胞內鎮(zhèn)重物含量的改變，偽空胞的合成與破裂[22-23]. 糖類為主要鎮(zhèn)重物[24]，光照充足時，藻類通過光合作用積累糖類，使藻細胞質量密度增加，開始下沉[25]；光照受限時，呼吸作用占主導，糖類被不斷消耗，藻細胞因質量密度下降而上浮[26]. 本實驗也發(fā)現(xiàn)在光照度為2000 lx時，懸液中的藻細胞有輕微下沉，而無光照時，懸液的藻細胞略有增加. 因此，未超聲藻細胞的浮力調節(jié)可能是通過改變糖類含量實現(xiàn)的. 此外，超聲除藻主要是通過超聲產生的物理化學效應使偽空胞破裂和細胞下沉. 但是Rodriguez-Molares等[16]觀察超聲處理后銅綠微囊藻的沉降過程時發(fā)現(xiàn)藻細胞經超聲處理后，偽空胞能夠在24 h內重新形成. 超聲處理后，藻細胞重新上浮的影響因素很多，Lee等[5]觀察了光照和曝氣對藻細胞上浮的影響，發(fā)現(xiàn)光照是主要的影響因素，只有光照充足時藻細胞才能上浮. Deacon等[27]研究了超聲后藻細胞偽空胞的恢復，發(fā)現(xiàn)在無光條件下有少量的新偽空胞合成，光照度在0～1200 lx范圍內，偽空胞合成的數(shù)量與光強呈線性關系，在光照度為2000 lx時新合成偽空胞的數(shù)量最大. 本實驗也發(fā)現(xiàn)在無光照條件下藻細胞上浮率較小，可能是由于前期細胞內儲存的物質與能量被呼吸作用消耗，偽空胞合成受抑制，而在有光照條件下，光合作用為偽空胞合成提供物質和能量[28].

周貝等[29]研究了溫度對銅綠微囊藻細胞浮力的影響，發(fā)現(xiàn)溫度低于20℃時銅綠微囊藻下沉，溫度高于20℃時銅綠微囊藻上浮. 溫度對藻細胞浮力的影響與糖類利用能力密切相關[30]. 當溫度低于20℃時，藻細胞的生長代謝速率降低，但此時細胞仍具有較強的光合作用，因此光合作用產生的糖類大大超過了細胞需求，糖類累積后使細胞因質量密度增大而下沉；而在較高溫度(20～30℃)時，細胞具有較高的生長速率，較強的光合作用產生了大量糖類，為細胞的快速生長分裂提供了物質基礎，而較高的代謝速率及時分解了糖類，導致細胞質量密度減小，浮力增加[29]. 此外，關于溫度對超聲后藻細胞浮力的影響，有研究者發(fā)現(xiàn)在溫度適宜時，被超聲破壞的偽空胞經過一定時間后又會被合成，浮力恢復，魚腥藻的偽空胞達到完全恢復需要5 d，而微囊藻則只需2 d[17]. Brookes等[31]研究表明，銅綠微囊藻蛋白含量隨著溫度的升高而增大，細胞內蛋白含量變化趨勢與細胞內偽空胞數(shù)量一致. 本研究也表明隨著溫度升高，超聲后藻細胞的浮力逐漸恢復. 結合光合活性變化來看，超聲處理后在15℃和20℃溫度下培養(yǎng)時藻細胞的光合活性逐漸恢復，糖類產量增加，但此時細胞代謝速率較低，糖類的分解速率小于積累速率，因此，藻細胞質量密度增加，細胞下沉. 在25℃培養(yǎng)時，超聲后藻細胞光合活性也得到恢復，但是此時藻細胞的代謝速率較高，能及時分解光合作用產生的糖類，使藻細胞上浮.

本研究表明在較高光強(2000 lx)和溫度(25℃)下恢復培養(yǎng)，超聲處理的藻細胞能夠上浮，這與Lee等[5]的研究結果一致. 在弱光(<200 lx)和低溫(≤20℃)的恢復培養(yǎng)條件下，藻細胞基本無上浮. 因此，超聲控藻應選擇低光強、低溫的時間段，使其徹底喪失上浮能力.

藻細胞漂浮率與光照度的回歸斜率(8.823)明顯大于漂浮率與溫度的回歸斜率(2.541)，可見光照度對藻細胞的浮力恢復影響更大(圖7)，原因可能有以下兩點：一是光照度調節(jié)光合速率，影響新偽空胞合成所需的物質和能量；二是超聲處理過程中，可能部分偽空胞僅僅坍塌而未破裂，這些偽空胞內的氣體受超聲擠壓而泄漏，使其空癟，恢復生長后光合作用釋放的氧氣使這些偽空胞重新充氣飽滿[32].

圖7 光照和溫度對超聲后藻細胞恢復的影響Fig.7 Changes of algae floatation at different light intensity and temperature conditions

4 結論

1)本研究中，最優(yōu)參數(shù)為：超聲強度0.0353 W/cm3，處理時間60 s. 此時藻細胞沉降量最大，藻細胞濃度和胞內葉綠素濃度均保持不變，表明超聲未破碎藻細胞，細胞內含物不會泄漏污染水質.

2)超聲處理后，較高光照度(2000 lx)和溫度(25℃)更能促進微囊藻恢復生長并獲得浮力，且光照的影響更大，建議野外超聲除藻選擇低光強、低溫的時段，采用60 s間歇式多次處理，使微囊藻徹底沉降，喪失再懸浮能力.

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Influence of ultrasonic intensity on sinking ofMicrocystiscolonies and their floating process under different light and temperature conditions

TAN Xiao1, SUN Yutong1, DUAN Zhipeng1, ZENG Qingfei2, ZHENG Xueying1& LIU Qianqian1

(1：KeyLaboratoryofIntegratedRegulationandResourceDevelopmentonShallowLakeofMinistryofEducation,CollegeofEnvironment,HohaiUniversity,Nanjing210098,P.R.China)(2：StateKeyLaboratoryofLakeScienceandEnvironment,NanjingInstituteofGeographyandLimnology,ChineseAcademyofSciences,Nanjing210008,P.R.China)

Inhibition effect of different ultrasonic intensities was investigated by usingMicrocystiscolonies from Lake Taihu, and the aim of this study was to obtain the optimal ultrasound parameters. The floating character ofMicrocystiscolonies after sonication was cultured under different illumination intensity and temperature conditions. Results showed that sonication for 60 s at 0.0353 W/cm3was an optimal parameter, which led to an immediate sedimentation (up to 80%) markedly. In the experiment, the algal cell concentration and chlorophyll-a concentration were unchanged, which suggested that algal cells remained intact and cell inclusions did not leak to contaminate water quality. Light and temperature played important roles in the floating process ofMicrocystiscolonies, but light was a more significant factor during the process. Under 2000 lx at 25℃,the floating rate of algal cells could restore to the normal level after 120 h, while the floating rate of algal cells after sonication did not change significantly at a relatively low temperature (≤20℃). In comparison, at a higher temperature of 25℃, the floating rate increased after 72 h which could restore to 80% of the level in control group after 120 h. Therefore, the ultrasonic control of algal blooms in lakes should choose a weak illumination intensity and low temperature condition.

Microcystiscolonies; ultrasonic intensity; exposure time; sedimentation; floating rate; illumination; temperature; Lake Taihu

國家自然科學基金項目(31470507)、中央高?？蒲袠I(yè)務費項目(2013B32414)和江蘇省優(yōu)勢學科平臺項目(PAPD)聯(lián)合資助. 2016-07-25收稿； 2016-12-02收修改稿. 譚嘯(1980～)，男，博士，副教授； E-mail： biotan@163.com.

DOI 10.18307/2017.0514