陳翩翩 林 倩 朱群燕 趙應(yīng)征

(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325025)

腎和肺的去細胞器官支架體外灌注制備方法的優(yōu)化

陳翩翩 林 倩 朱群燕 趙應(yīng)征*

(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325025)

研究采用體外灌注法制備腎和肺去細胞器官支架的最優(yōu)方法。將10只成年SD雄鼠作為器官支架供體，進行去細胞器官支架制備，不同器官采用不同血液循環(huán)方法進行體外大氣壓灌注(基于大氣壓力往循環(huán)體系中注入)0.75% SDS、1% Triton X-100、0.1% H2O2制備器官去細胞支架，通過HE染色、DAPI熒光染色方法檢測去細胞程度，通過掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)和去細胞程度，通過阿利新藍- 過碘酸雪夫氏染法(AB- PAS)、Masson染色、免疫組化染色方法檢測去細胞器官支架的成分保留。結(jié)果表明，采用體外大氣壓灌注法制備的去細胞器官支架能有效去除細胞，且糖原、膠原、纖連蛋白(Fibronectin)、彈性蛋白(Elastin)、層粘連蛋白(Laminin)、IV 型膠原(Collagen IV)等有效保留，同時支架能保持良好的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)。通過大氣壓注入去細胞化試劑，能有效保留良好的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，同時達到有效的去細胞程度(去細胞程度大于99%)，且營養(yǎng)成分能有效保留。

體外灌注；去細胞化；器官支架

引言

在臨床上，器官原位移植已經(jīng)成為臟器不可逆性損傷、衰竭的唯一治療手段，而每年急需移植的人數(shù)大幅上升，許多患者在等待器官的過程中失去生命[1]，移植供體缺乏成為器官移植技術(shù)的瓶頸。同時，移植術(shù)后的排斥反應(yīng)也存在很大障礙。

近些年，組織器官工程學(xué)的快速發(fā)展為克服器官移植術(shù)后的排斥問題提供了解決思路。具有功能的器官移植替代物已經(jīng)在體外被創(chuàng)造，并且成功地被移植入受體[2]。本課題意在制備有效的器官支架材料，去細胞支架擁有良好的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，且保留許多的營養(yǎng)成分，相對于其他的支架材料，去細胞器官支架的成分和結(jié)構(gòu)更加接近于活體器官，同時，它的低免疫原性以及高生物相容性使它更適用于移植，成為一種最具優(yōu)勢的移植替代物。

1 材料與方法

1.1 材料

1)實驗動物：Sprague Dawley成年雄性大鼠(SD大鼠)，10只，體重(300±20)g，溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

2)試劑：Triton X- 100(阿拉丁，中國)，SDS(阿拉丁，中國)，F(xiàn)ibronectin(abcam，英國)，Elastin(abcam，英國)，Laminin(abcam，英國)，Collagen IV(abcam，英國)。

3)儀器： IX71 倒置研究型顯微鏡(Olympus公司，日本)，掃描電鏡(Hitachi, H- 7500, 日本)。

1.2 方法

1.2.1灌注法制備去細胞支架過程

基于器官的血液循環(huán)，以腎和肺支架制備為代表，優(yōu)化灌注方法，目前大多數(shù)的去細胞支架的灌注法采用蠕動泵等外力壓入各種去細胞試劑[3]，其去細胞程度和成分保留均能達到效果，但是結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的完整性會因灌注時蠕動泵的壓力過強而在一定程度上產(chǎn)生破碎，而本研究的體外灌注法是通過大氣壓導(dǎo)入去細胞試劑，最大程度緩和了壓強過大導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的破壞。制備過程如下：首先構(gòu)建臟器的閉合血液循環(huán)通路，接著進行去細胞化過程：1% Triton X- 100灌注3個循環(huán)→PBS灌注3個循環(huán)→0.75% SDS灌注3個循環(huán)→PBS灌注3個循環(huán)→0.1% H2O2灌注3個循環(huán)→PBS灌注3個循環(huán)。以上每次循環(huán)使用250 mL試劑。

1% Triton X- 100用于破細胞膜，0.75% SDS能有效去除細胞成分，筆者采用的Triton X- 100和SDS是較為溫和的洗滌劑，其對細胞外基質(zhì)的破壞可以降到最低[4]，0.1% H2O2用于殺菌，PBS用于清除殘留的細胞碎片。整個過程器官都處于懸空，上面接著留置針，其針連著25 mL針筒，試劑都加入針筒，通過大氣壓，試劑緩慢通過器官進行去細胞化過程。通過大氣壓力把試劑導(dǎo)入器官，相對于手動導(dǎo)入試劑或蠕動泵導(dǎo)入試劑，能更完整地保持血管脈絡(luò)網(wǎng)，避免其由于過強的壓力而破碎、滲漏。

灌注法制備大鼠腎和肺去細胞化支架：制備腎去細胞化支架時，從單側(cè)腎動脈插入留置針，伴行的腎靜脈剪開切口，形成單腎循環(huán)，手術(shù)線結(jié)扎固定留置針，注入生理鹽水沖洗血液后，移出體外，將腎懸掛在簡易裝置中；而肺的灌注采取心肺循環(huán)灌注，先從下腔靜脈注入肝素抗凝，再結(jié)扎心臟主動脈弓，將留置針從右心室插入、結(jié)扎固定，灌注生理鹽水沖洗血液后，最后將心肺一起移出體外，懸掛在簡易裝置中。接著分別加入去細胞試劑進行去細胞化處理(見圖1、2)。經(jīng)過上述處理獲得去細胞化腎支架(dKECM)和去細胞化肺支架(dLECM)。

圖1 大鼠肺組織去細胞化過程。(a)箭頭處表示大鼠下腔靜脈；(b)往大鼠下腔靜脈打入肝素；(c)結(jié)扎大鼠心臟主動脈弓，再將留置針從右心室插入、結(jié)扎固定；(d)將肺組織移入裝置；(e)組織去細胞化前近觀；(f)組織去細胞化后；(g)組織去細胞化后近觀Fig.1 The preparation of rat lung decellularization. (a) Arrow represents the inferior vena cava of rats; (b) Inject heparin to the inferior vena cava of rats; (c) Ligate rat cardiac aortic arch and insert the detained needle to the right ventricle and fasten it; (d) Move the tissue to appliance; (e) Amplification of tissue before decellularization; (f) The final decellularization; (g) Amplification of final decellularized tissue

圖2 大鼠腎組織去細胞化過程。(a)往大鼠單側(cè)腎動脈插入留置針，伴行的腎靜脈剪開切口，形成單腎循環(huán)； (b)將組織移入裝置；(c)組織去細胞化后近觀；(d)組織去細胞化過程中的形態(tài)變化Fig.2 The preparation of rat kindey decellularization. (a) Insert the detained needle into the unilateral renal artery and cut the following renal vein with an incision, developing a single renal circulation; (b) Move the tissue to appliance; (c) Amplification of final decellularized tissue; (d) The tissue changes during decellularized process.

1.2.2 去細胞程度檢測

通過HE染色和DAPI熒光染核，對去細胞化程度進行檢測。

1.2.3 去細胞化器官支架的成分保留

通過Masson染色檢測其膠原纖維的保留；AB- PAS染色檢測其糖原的保留；免疫組化染色檢測纖連蛋白(Fibronectin)、彈性蛋白(Elastin)、層粘連蛋白(Laminin)、IV 型膠原(Collagen IV)的保留。

1.2.4去細胞化器官支架結(jié)構(gòu)的完整性

通過掃描電鏡可以看出去細胞器官支架的脈絡(luò)網(wǎng)的完整性。

1.2.5 去細胞化器官支架免疫原性檢測

通過皮下埋植去細胞肺支架以及腦內(nèi)填充去細胞化腎支架，于第7 d處理老鼠后，肉眼觀察組織的炎癥情況以及RT- PCR檢測埋植物周圍組織的CD68的表達量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以 (x±s) 表示，兩組間差異比較行t檢驗，P<0. 05 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎和肺去細胞程度評價

通過HE染色和DAPI染色顯示出dLECM(見圖3)、dKECM(見圖4)和正常肺、腎組織相比，沒有細胞核的表達，從掃描電鏡結(jié)果能觀察到其保留了器官完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)。

圖3 肺去細胞程度評價。(a)肺組織的HE染色；(b)肺組織的DAPI染色；(c) 肺去細胞支架的HE染色；(d)肺去細胞支架的DAPI染色；(e)肺去細胞支架的掃描電鏡圖Fig.3 Evaluation of the decellularized lung. (a) HE stain of normal lung; (b) DAPI stain of normal lung; (c) HE stain of decellularized lung; (d) DAPI stain of decellularized lung; (e) SEM result of decellularized lung.

圖4 腎去細胞程度評價。(a)腎組織的HE染色；(b)腎組織的DAPI染色；(c)腎去細胞支架的HE染色；(d)腎去細胞支架的DAPI染色；(e)腎去細胞支架的掃描電鏡圖Fig.4 Evaluation of the decellularized kindey. (a) HE stain of normal kindey; (b) DAPI stain of normal kindey; (c) HE stain of decellularized kindey; (d) DAPI stain of decellularized kindey; (e) SEM result of decellularized kindey.

圖5 去細胞腎和肺支架的免疫原性檢測。(a)肺去細胞支架大鼠皮下埋植7 d；(b)腎去細胞支架埋入大鼠腦；(c)正常大鼠大腦；(d)假手術(shù)組；(e)腎去細胞支架埋入大鼠腦7 dFig.5 Immunogenicity detection of decellularized kidney and lung. (a) Lung scaffolds subcutaneous embedment in normal rat for 7 days; (b) Lung scaffolds embedded in rat brain. (c) Normal rat brain; (d) Control group; (e) Lung scaffolds embedded in rat brain for 7 days

2.2 去細胞腎和肺支架的免疫原性檢測

肺去細胞支架埋植入大鼠皮下7 d后(見圖5(a))，可以看出，埋植物與周圍組織并沒有發(fā)生炎癥。而腎去細胞支架埋植入腦的示意圖(見圖5(b))以及7 d后狀況(見圖5(e))，對比與正常大腦(見圖5(c))和假手術(shù)組大腦(見圖5(d))可觀察出其沒有明顯的炎癥，并且組織相容性良好。取移植后的腦組織周圍組織進行RT- PCR檢測CD68含量的表達，結(jié)果顯示(見圖6)，埋植物周圍組織沒有炎癥發(fā)生，說明本課題組制備的去細胞化肺、腎支架有良好的免疫原性。

圖6 經(jīng)去細胞組織移植后腦周圍組織的CD68 mRNA水平Fig.6 Relative CD68 mRNA levels in surrounding brain tissues after decellularized tissue transplantation.

2.3 去細胞腎和肺支架的成分保留

從AB- PAS染色看出dLECM(見圖7)、dKECM(見圖8)的糖原、中性黏蛋白等各種糖蛋白的保留(呈紫紅色)、Masson染色看出膠原纖維的保留(呈藍色)、免疫組化染色結(jié)果可看出支架能有效保留Fibronectin、Elastin、Laminin、Collagen IV(呈棕色陽性點)。

圖7 肺支架成分保留(上為肺組織、下為肺去細胞支架)。(a) Masson染色；(b) AB- PAS染色；(c) Elastin免疫組化染色； (d) Fibronectin免疫組化染色； (e) Collagen Ⅳ免疫組化染色Fig.7 Composition retaining in lung scaffold(The above is fresh lung, below is the decellularized lung). (a) Masson stain; (b)AB- PAS stain; (c) Elastin stain; (d) Fibronectin stain; (e) Collagen Ⅳ stain

圖8 腎支架成分保留(上為腎組織、下為腎去細胞支架)。(a) Masson染色；(b) AB- PAS染色；(c)腎組織Elastin免疫組化染色； (d)腎組織Fibronectin免疫組化染色； (e)腎組織Laminin免疫組化染色； (f)腎去細胞支架Collagen Ⅳ免疫組化染色Fig.8 Composition Retaining in kidney scaffold. The above is fresh kidney, below is the decellu.larized kidney(a) Masson stain; (b) AB- PAS stain; (c) Elastin stain; (d) Fibronectin stain; (e) Laminin stain;(f)Collagen Ⅳstain

3 討論

去細胞支架是通過不同方法去除組織或者器官的細胞以及可溶性蛋白，使其達到低免疫原性、高生物相容性的天然生物支架材料。對比于現(xiàn)有的體外灌注方法，大多數(shù)都是采用蠕動泵等額外的壓力往器官中注入試劑，這額外的壓力在一定程度上會破壞支架的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，而本實驗主要采取大氣壓灌注導(dǎo)入試劑，最大程度地避免由于過強的壓力導(dǎo)致結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的破碎，在保留完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的同時，去細胞化程度也達到要求。

目前，在血管、膀胱以及氣管等組織的工程化已經(jīng)取得可喜的進步。而整個器官重建要求在移植后血液能迅速支持，這就增加了支架制備和再細胞化的難度。因此，植入性生物人工器官發(fā)展的障礙之一，是缺乏能重現(xiàn)整個組織功能的生物學(xué)相適應(yīng)的器官支架器官[5]和適合組織形成的生長環(huán)境[6]。

在過去的幾年里，去細胞支架已經(jīng)成功地用于修復(fù)各種損傷或病變的器官[7]，比如皮膚[8]、氣管[9- 10]、食道[11- 12]、心[13- 15]等。

為了有效去除器官的細胞，保留超微結(jié)構(gòu)和細胞外基質(zhì)成分[16]，大多數(shù)實體器官的去細胞化過程都采用灌注法[3, 17]，基于它通過脈絡(luò)循環(huán)來清除所有的細胞成分，并維持器官細胞外基質(zhì)的完整性[18- 19]，同時保留了其原始的血管脈絡(luò)系統(tǒng)，這種能保持完整結(jié)構(gòu)脈絡(luò)的去細胞化支架能被用于種植培養(yǎng)多種細胞[20]。而采取的灌注法能有效去除細胞成分并保留完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)，同時保留膠原、糖原以及各種營養(yǎng)蛋白，相對于傳統(tǒng)意義上的灌注法，采取了依靠大氣壓導(dǎo)入去細胞化試劑，能最大程度地保留器官的血管脈絡(luò)網(wǎng)，有效地避免其由外界壓力過強導(dǎo)致的血管破裂。在移植替代物中，可以看到去細胞化器官支架的低免疫原性排除了傳統(tǒng)移植的免疫排斥反應(yīng)，同時其保留的營養(yǎng)成分和結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)又是一般生物支架材料所不具備的，并且由于其完整的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)能讓接種的細胞黏附、爬行、增殖，有效實現(xiàn)去細胞支架的再細胞化。

本研究證明，基于血循環(huán)通路的體外大氣壓自然灌注法能有效制備去細胞化器官支架，同時確立了一個有效且快速的大鼠器官去細胞方法，為以后支架的再細胞化及體內(nèi)移植奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本課題的體外灌注法制備的去細胞器官支架相對于大多數(shù)通過蠕動泵灌注制備的去細胞支架，不僅有效去除細胞，保留營養(yǎng)成分，消除免疫原性，且最大程度地保存了器官的結(jié)構(gòu)脈絡(luò)網(wǎng)的完整性，這為開發(fā)組織工程支架帶來新的機遇,開拓了良好前景，是組織工程學(xué)進展的關(guān)鍵一步。

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The Advanced Method of Kidney and Lung De- Cellularized Scaffold through in vitro Perfusion

Chen Pianpian Lin Qian Zhu Qunyan Zhao Yingzheng*

(School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzho 325035u, Zhejiang, China)Key words：in vitro perfusion; de- cellularized; organ scaffold

10.3969/j.issn.0258- 8021. 2017. 03.019

2016- 07- 26， 錄用日期:2016- 01- 25

國家自然科學(xué)基金(81571392)；浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才和溫州市551高層次人才創(chuàng)新技術(shù)項目。

R318

D

0258- 8021(2017) 03- 0380- 05

*通信作者(Corresponding author)，E- mail: pharmtds@163.com