程麗英，任紅濤，劉樹興

(1.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，鄭州 450044；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450002；3.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

大孔吸附樹脂法與高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的比較研究

程麗英1，任紅濤2，劉樹興3

(1.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，鄭州 450044；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450002；3.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

選擇大孔吸附樹脂法和高速逆流色譜法對(duì)虎杖中白藜蘆醇進(jìn)行分離純化。通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化以及對(duì)兩種方法的比較發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大孔吸附樹脂法分離純化所得的白藜蘆醇得率稍高，為0.21%，但純度偏低，僅為51%；經(jīng)高速逆流色譜法分離純化所得的白藜蘆醇得率稍低，為0.186%，但純度大于96%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大孔吸附樹脂法所得。

虎杖；白藜蘆醇；大孔吸附樹脂；高速逆流色譜

虎杖是我國傳統(tǒng)的中藥，白藜蘆醇作為虎杖的有效成分具有抗氧化、抗菌、抗癌、預(yù)防心血管疾病等多種藥理活性，[1]越來越受到人們的重視。目前，關(guān)于虎杖中白藜蘆醇的提取及分離純化的方法研究較多，本文選擇大孔吸附樹脂法與高速逆流色譜法，對(duì)虎杖提取液中白藜蘆醇的分離純化進(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器

虎杖，市購；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，外購；無水乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、濃鹽酸、乙醚等皆為分析純；X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、D-101樹脂，外購。

1.2 主要儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀，美國Waters公司；TBE-300型高速逆流色譜(分離)儀，上海同田生化技術(shù)有限公司；752型紫外-可見分光光度計(jì)，上海精密儀器有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱，成都玻璃儀器廠；JA5003型電子天平，上海精科儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

對(duì)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外圖譜掃描，確定白藜蘆醇紫外最大吸收峰，通過對(duì)白藜蘆醇的紫外分光測(cè)定、硅膠薄層層析、紫外圖譜掃描及高效液相色譜[2-3]測(cè)定，建立紫外分光光度計(jì)跟蹤檢測(cè)、薄層層析、紫外圖譜掃描及高效液相色譜定性定量測(cè)定的方法。

1.3.2 白藜蘆醇粗提液的準(zhǔn)備[4]

將干燥片狀的虎杖根莖進(jìn)行粉碎處理，然后過60目篩。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱取一定量粉碎合格的虎杖原料，按料液比1:20(g/mL)，加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇與丙酮1:1混合溶液，調(diào)整pH為4，在40℃條件下回流提取30min，共提取2次，然后抽濾，棄去濾渣，合并濾液。之后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收有機(jī)溶劑，得到虎杖有效成分的粗提物備用。

1.3.3 分離純化

大孔吸附樹脂法分離純化：選擇5種不同的大孔吸附樹脂對(duì)虎杖提取液進(jìn)行靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)，確定白藜蘆醇分離純化最適合的大孔吸附樹脂及吸附解吸條件。

高速逆流色譜法分離純化：考察不同的溶劑系統(tǒng)，根據(jù)虎杖中白藜蘆醇分離純化的結(jié)果選出最佳的溶劑系統(tǒng)及分離條件。[5-6]

1.3.4 高效液相色譜測(cè)定

將利用大孔吸附樹脂法及高速逆流色譜法分離純化所得產(chǎn)品進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)面積外標(biāo)法得出白藜蘆醇含量，并計(jì)算求得產(chǎn)品純度及得率。產(chǎn)品純度為白藜蘆醇質(zhì)量(有效成分收集液的濃度×收集液體積)與有效成分收集液濃縮烘干后的固形物質(zhì)量之比，得率為白藜蘆醇質(zhì)量與虎杖干重之比。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

根據(jù)白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的紫外掃描圖譜(圖略)，選擇306nm作為白藜蘆醇的測(cè)定波長(zhǎng)。通過測(cè)定不同濃度白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品在306nm下的吸光度，經(jīng)計(jì)算得出白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=7.6582x+0.0003(y為濃度，μg/mL；x為吸光度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9979。

2.2 大孔吸附樹脂的篩選[7]

樹脂吸附解吸量的大小是大孔吸附樹脂法分離純化的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)選取5種大孔吸附樹脂經(jīng)預(yù)處理后對(duì)虎杖提取液中的白藜蘆醇進(jìn)行靜態(tài)吸附與解吸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 不同樹脂對(duì)白藜蘆醇的吸附解吸性能

由表1可以看出，NKA-Ⅱ樹脂的吸附率最高，其次為NKA-9，其他三種樹脂吸附性能較差。在解吸方面，AB-8樹脂最好，NKA-9次之?？紤]到NKA-9樹脂的吸附率和解吸率都較高，故選擇NKA-9作為最佳樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)。

2.3 大孔吸附樹脂法吸附條件的確定

2.3.1 料液濃度對(duì)吸附效果的影響

分次取18mL樹脂濕法裝柱，制取6份含白藜蘆醇總量相同且高于該樹脂飽和吸附量但濃度不同的虎杖提取液，上大孔吸附樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，在白藜蘆醇總量相同的情況下，隨著上柱濃度的增大，吸附率先增大后減小， 3～4mg/mL上柱濃度時(shí)吸附率最高，吸附量最大。因此，選擇上柱濃度在3～4mg/mL之間。

圖1 料液濃度對(duì)吸附率的影響

2.3.2 上柱速率對(duì)吸附率的影響

用蠕動(dòng)泵分別控制6個(gè)不同的流速進(jìn)行上柱吸附，通過上柱前后溶液有效成分的濃度差，計(jì)算吸附率，結(jié)果見圖2。可以看出，上柱速率越大越不利于吸附，但上柱速率過小樹脂吸附消耗的時(shí)間就多，當(dāng)上柱速率超過1.0mL/min后，吸附率明顯下降。綜合考慮吸附率及效率，選擇流速為1.0mL/min，即3.3BV/h。

圖2 上柱速率對(duì)吸附率的影響

2.3.3 上樣量對(duì)吸附率的影響

分次吸取2mg/mL濃度的粗提液樣品7mL，8mL，9mL，10mL，11mL和12mL，上樣于NKA9大孔吸附樹脂的色譜柱中，靜置15min，用蒸餾水淋洗至析出液無色，再用75%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，測(cè)定并計(jì)算吸附率。由圖3可以看出，當(dāng)上樣量為8mL時(shí)吸附效果最好。上樣量繼續(xù)增大，則超過了樹脂的飽和吸附量，吸附率反而下降。因此，選擇上樣量為8mL，即0.45BV。

圖3 上樣量對(duì)吸附率的影響

2.3.4 進(jìn)樣 pH值對(duì)吸附率的影響

分別調(diào)整不同的樣液pH，進(jìn)行上樣吸附，并測(cè)定吸附率，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，隨著pH增加，吸附率先增加后下降，在pH4時(shí)，吸附率達(dá)到峰值。因此，確定上柱液的pH為4用于操作。

圖4 pH對(duì)吸附率的影響

2.4 大孔吸附樹脂法解吸條件的確定

2.4.1 解吸劑濃度的確定

分別選擇體積分?jǐn)?shù)20%、35%、50%、75%、100%的乙醇溶液對(duì)已經(jīng)吸附有效成分的樹脂進(jìn)行洗脫，結(jié)果見圖5。可以看出，隨著乙醇濃度的升高，白藜蘆醇的解吸率也隨之升高，當(dāng)濃度上升到75%以上時(shí)，解吸率增加不明顯。故選用75%乙醇溶液進(jìn)行解吸操作。

圖5 不同濃度乙醇對(duì)解吸的影響

2.4.2 洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

以不同流速的75%乙醇對(duì)吸附樹脂進(jìn)行解吸，結(jié)果見圖6?？梢钥闯?，解吸率隨流速的增大而減小，但隨著流速的增大，生產(chǎn)效率會(huì)提高。綜合考慮，確定洗脫流速為0.9mL/min，即3BV/h。

圖6 洗脫流速對(duì)解吸的影響

2.4.3 洗脫劑的pH值對(duì)解吸效果的影響

考慮到白藜蘆醇為偏酸性物質(zhì)，偏堿性條件有利于白藜蘆醇的解吸，因此選擇pH7，pH8，pH9，pH10，pH11對(duì)白藜蘆醇的解吸情況進(jìn)行考察，結(jié)果見圖7。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解吸液在pH8效果最好。

2.4.4 動(dòng)態(tài)解吸曲線

選擇上柱液濃度3mg/mL，上柱量7mL。充分吸附后，以上述實(shí)驗(yàn)選擇的解吸條件進(jìn)行解吸操作，以解吸液體積為橫坐標(biāo)，白藜蘆醇濃度為縱坐標(biāo)，繪制解吸曲線，見圖8?？梢钥闯觯行С煞执蠖荚?0～60mL的洗脫液中，隨著乙醇的繼續(xù)洗脫，剩余少量的白藜蘆醇也逐漸被解吸下來，共需解吸液約135mL，即7.5BV(樹脂床體積)。

圖7 pH對(duì)解吸的影響

圖8 白藜蘆醇解吸曲線

2.5 高速逆流色譜法分離純化白藜蘆醇

2.5.1 溶劑體系的確定[8]

高速逆流色譜法分離純化白藜蘆醇的關(guān)鍵在于溶劑系統(tǒng)的選擇。本文比較了兩種不同的溶劑系統(tǒng)，一種是氯仿、甲醇、水系統(tǒng)，其比例為4:3:2；另一種是乙酸乙酯、乙醇、水系統(tǒng)，其比例為10:1:10。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第一種溶劑系統(tǒng)對(duì)于虎杖中的有效成分分離效果較好。因此，選擇氯仿、甲醇、水的比例為4:3:2作為高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的溶劑體系。

2.5.2 分離條件的確定

經(jīng)綜合考察與比較，選擇轉(zhuǎn)速850r/min，流速2mL/min，進(jìn)樣量5mL提取液，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm作為分離條件。在確定的溶劑體系及分離條件下所得虎杖提取樣品的高速逆流色譜見圖9。可以發(fā)現(xiàn)，虎杖粗提物經(jīng)過逆流色譜分離純化得5個(gè)組分。分別收集，經(jīng)薄層檢測(cè)及紫外圖譜掃描，發(fā)現(xiàn)第五個(gè)峰所得物質(zhì)為白藜蘆醇，且純度較高。

2.6 白藜蘆醇的高效液相色譜分析

將通過大孔吸附樹脂法及高速逆流色譜法分離純化所得的白藜蘆醇產(chǎn)品上高效液相色譜柱，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，利用大孔吸附樹脂法分離純化所得白藜蘆醇得率為0.21%，純度為51%；利用高速逆流色譜分離純化所得白藜蘆醇得率為0.186%，純度大于96%。白藜蘆醇的高效液相色譜圖見圖10。

圖9 虎杖提取樣品高速逆流色譜圖

圖10 白藜蘆醇樣品高效液相色譜圖

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)考察了5種大孔吸附樹脂對(duì)虎杖中白藜蘆醇的吸附解吸性能，發(fā)現(xiàn)NKA9樹脂對(duì)白藜蘆醇有較好的吸附和解吸效果。針對(duì)NKA9型樹脂進(jìn)行了吸附解吸工藝條件的優(yōu)化，純化工藝為：上樣濃度4mg/mL，上樣速率3.3BV/h，上樣量0.45BV，pH4條件下吸附；解吸采用7.5BV的75%酒精，洗脫流速3 BV/h，pH為8。

(2)優(yōu)化了高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的工藝條件。選擇氯仿、甲醇、水的比例為4:3:2作為溶劑體系，轉(zhuǎn)速850r/min，流速2mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。

(3)通過對(duì)大孔吸附樹脂法及高速逆流色譜法分離純化虎杖中白藜蘆醇的比較發(fā)現(xiàn)，大孔吸附樹脂法作為低成本的分離純化方法，所得白藜蘆醇成品的得率為0.21%，純度為51%，純度較低；高速逆流色譜法相對(duì)生產(chǎn)周期短，所得白藜蘆醇得率為0.186%，純度大于96%，純度較高，具有一定的應(yīng)用推廣價(jià)值。

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(責(zé)任編輯 姚虹)

Comparative Study on Separation and Purification of Resveratrol from Polygonum Cuspidatum by Macroporous Adsorption Resin and HSCCC

CHENG Li-ying1, REN Hong-tao2, LIU Shu-xing3

(1.College of Chemical Engineering and Food, Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou450044, China；2. College of Food Science & Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；3.College of Food & Biological Engineering, Shanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

In this paper, two methods are selected to separate and purify of the resveratrol from Polygonum cuspidatum, macroporous adsorption resin method and HSCCC method. Through the optimization of experimental condition and the comparison of two methods, the results are as follows: The resveratrol yield is slightly higher by the macroporous adsorption resin purification, it is 0.21%,while the purity is low, only 51%; the resveratrol yield is slightly lower by the HSCCC method, and it is 0.186%. However, the purity by HSCCC is over 96%, which is much higher than macroporous adsorption resin purification.

Polygonum cuspidatum ; resveratrol; macroporous adsorption resin; HSCCC

2017-06-13

程麗英(1980—),女，河北石家莊人，工學(xué)碩士，鄭州工程技術(shù)學(xué)院化工食品學(xué)院講師，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2017.04.024

TQ461

A

1008-3715(2017)04-0113-04