吳麗櫻，成玉梁，郭亞輝，孫秀蘭，錢和

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

豆腐在不同儲藏溫度下腐敗菌菌相比較

吳麗櫻，成玉梁，郭亞輝，孫秀蘭，錢和*

（江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

以盒裝內(nèi)酯豆腐和簡易包裝老豆腐為研究對象，包括這兩種豆腐的新鮮樣品和在不同溫度儲藏后（4、25、37℃）的腐敗樣品，提取樣品細菌基因組后對16S rRNA V3區(qū)基因片段擴增，采用MiSeq高通量測序技術(shù)，分析腐敗菌菌相組成及細菌多樣性情況。結(jié)果表明：盒裝內(nèi)酯豆腐的菌相復雜程度小于簡易包裝老豆腐，盒裝內(nèi)酯豆腐中的細菌主要由芽孢桿菌屬（Bacillus）組成，比例均在90%以上。簡易包裝老豆腐在4℃腐敗后相比其他兩個溫度下的樣品，細菌多樣性更豐富。明串珠菌屬（Leuconostoc）是25℃和37℃下腐敗老豆腐的主要優(yōu)勢菌，分別占到了71%和80%。高通量測序相比于傳統(tǒng)的可培養(yǎng)技術(shù)，反映的微生物信息更加接近于真實的樣品生態(tài)，此研究可為小型豆腐生產(chǎn)企業(yè)的衛(wèi)生控制提供參考。

盒裝內(nèi)酯豆腐；簡易包裝老豆腐；高通量測序；腐敗菌菌相

豆腐在我國是深受百姓喜愛的傳統(tǒng)美食，價格低廉，美味可口，又能提供豐富的蛋白質(zhì)及多種功能成分，在日常膳食中有著不可取代的地位[1]。目前中國的豆制品生產(chǎn)基本仍以地方性小企業(yè)、小作坊為主，存在生產(chǎn)規(guī)模小，衛(wèi)生狀況差，自動化程度低等問題[2]。豆腐制品含水量高，營養(yǎng)豐富，為微生物提供了理想的繁殖條件，極易腐敗變質(zhì)，阻礙了豆制品行業(yè)向規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

目前對于豆腐中腐敗菌的研究大都基于傳統(tǒng)的可培養(yǎng)技術(shù)，其結(jié)果不能很好地還原樣品中菌相的真實狀態(tài)。而新興的二代測序技術(shù)能夠大規(guī)模且全面地解析微生物多樣性，在發(fā)酵[3]、土壤[4-5]、醫(yī)學[6]等各個領(lǐng)域都發(fā)揮了重要作用，徹底革新了微生物生態(tài)學研究，但該技術(shù)在腐敗菌研究中的運用還較少。

盒裝內(nèi)酯豆腐和簡易包裝老豆腐是生活中最常食用的兩種豆腐，由于生產(chǎn)工藝和包裝條件的不同（生產(chǎn)工藝如圖1），兩種豆腐的腐敗菌相也有所差別。為了更好地了解其菌相差異，本文采用MiSeq測序分析了同一工廠生產(chǎn)的盒裝內(nèi)酯豆腐和簡易包裝老豆腐，分別在新鮮狀態(tài)，以及4、25、37℃下儲藏直到腐敗后微生物菌群多樣性，加深對導致豆腐腐敗的微生物的認識，同時對豆腐企業(yè)的工藝改進和質(zhì)量控制具有指導意義。

圖1 兩種豆腐生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 The process flow diagram of two kinds of tofu

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

簡易包裝老豆腐和盒裝內(nèi)酯豆腐：無錫香道嘉食品廠；DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit：OMEGA公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒：Life公司；Taq DNA Polymerase：Thermo 公司；Agencourt AMPure XP：Beckman公司。

Pico-21 臺式離心機：Thermo Fisher；TND03-H-H漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽：北京市六一儀器廠；Biodoc-IT凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；T100TMThermal Cyeler PCR儀：BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的準備

將豆腐廠剛下線的簡易包裝老豆腐和盒裝內(nèi)酯豆腐裝于有冰袋的保溫箱中，2 h之內(nèi)運回實驗室。將部分新鮮樣品存放于-80℃冰箱以便后續(xù)提取DNA。其余樣品，分別置于4、25、37℃下儲藏直至腐?。?0%感官評價小組成員判定其達到感官不可接受狀態(tài)）。分別用NF、LF表示新鮮的盒裝內(nèi)酯豆腐和簡易包裝老豆腐樣品；N4、N25、N37分別表示盒裝內(nèi)酯豆腐在4、25、37 ℃下貯藏腐敗后的樣品；L4、L25、L37 分別表示簡易包裝老豆腐在4、25、37℃下貯藏腐敗后的樣品。8個樣品的儲藏時間和樣品名稱見表1。

表1 樣品名稱和儲藏時間Table 1 The sample name and storage time

1.2.2 豆腐中細菌DNA的提取

將每一樣品取3個平行，稱取20 g豆腐樣品混勻，取2 mL液體加入無菌離心管中，10 000 r/min溫離心3 min，取上清具體提取步驟參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒使用說明書。將同一樣品的3個平行提取的DNA樣品進行混合。

1.2.3 16S rRNA V3區(qū)基因片段的擴增及Illumina雙末端測序

對于提取的基因組進行V3區(qū)的擴增，采用引物[7]341F：5’-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCC TACGGGNGGCWGCAG-3’，534R：5’-ACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGATTACCGCGGCTGCTGG-3’。PCR反應(yīng)體系見表2。

表2 V3區(qū)基因片段擴增的PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system for the amplification of V3 region gene fragment

PCR反應(yīng)程序如下：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s（5個循環(huán)）；94℃變性20 s，55℃退火 20 s，72℃延伸30 s（20個循環(huán)）；72℃最終延伸10 min；10℃保溫。使用2%濃度的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。DNA純化回收，利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1的等量混合后測序。每個樣品DNA量取10 ng，上機測序濃度為20 pmol。

1.2.4 生物信息學分析

1）測序完成后，為了保證信息分析質(zhì)量，必須對其進行質(zhì)控和過濾，將低質(zhì)量的片段舍棄。使用Usearch去除非擴增區(qū)域序列，校正錯誤序列，并調(diào)用uchime鑒定嵌合體，將去除嵌合體的序列與數(shù)據(jù)庫代表性序列進行blastn比對，在97%的相似水平下進行歸類操作得到OTU數(shù)（分類操作單元）。2）對8個樣品進行Alpha多樣性分析，使用Mothur（http：//www.mothur.org）計算香農(nóng)指數(shù)（Shannon），菌種豐富度指數(shù)（Chao1），辛普森指數(shù)（Simpson），覆蓋率（Coverage）和ACE等常用的α生物多樣性指數(shù)，衡量樣本中物種的多樣性[8]。3）菌群分類學分析：將全部OTU序列在Silva數(shù)據(jù)庫中比對，采用貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在屬水平（genus）統(tǒng)計每個樣品的群落組成，不滿足條件的序列則被歸為unclassified，將OTU進行屬的鑒定并作圖。4）Beta多樣性分析，利用Unifrac計算樣本間的距離，分析比較8個樣品之間的差別度量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品基因組的提取與擴增產(chǎn)物檢測

對8個樣品用試劑盒提取宏基因組后，對16SrRNA的V3區(qū)基因片段進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測后結(jié)果如圖2。

圖2 8個樣品的V3區(qū)擴增產(chǎn)物電泳檢測Fig.2 Electrophoresis detection of amplified products in V3 region of 8 samples

由圖2可知，目的條帶清晰，說明擴增結(jié)果良好，產(chǎn)物濃度適宜，可用于后續(xù)高通量測序。

2.2 Illumina測序，序列基本信息分析

8個樣品的高通量測序基本數(shù)據(jù)見表3。

如表3所示，8個樣品處理后剩余序列在56 000到72 000之間，OTU數(shù)在260到590之間。其中，盒裝內(nèi)酯豆腐的4個樣品的平均OTU數(shù)量約為341，簡易包裝老豆腐的OTU數(shù)目約為461，總體來看，老豆腐的腐敗菌種類要多于盒裝內(nèi)酯豆腐。新鮮的內(nèi)酯豆腐OTU數(shù)最少，而其他3個樣品的OTU數(shù)相近；而老豆腐的樣品中，隨著儲藏溫度的升高，樣品的OTU數(shù)逐漸減少。

表3 8個樣品的高通量測序基本數(shù)據(jù)Table 3 High-throughput sequencing basic data of 8 samples

2.3 Alpha生物多樣性分析

ACE和Chao1在生態(tài)學中用來估物種總數(shù)，數(shù)值越大，代表群落豐富度越高。Shannon和Simpson是反映的是樣品中微生物的多樣性。Shannon值越大，代表該樣品中微生物群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低[9]。

細菌多樣性指數(shù)見表4。

表4 細菌多樣性指數(shù)Table 4 Alpha-diversity data

由表4可知，老豆腐組的群落多樣性明顯高于內(nèi)酯豆腐組，N4和L4樣品的群落多樣性分別高于同組其他樣品，說明在4℃條件下，無論是內(nèi)酯豆腐還是老豆腐，細菌的種類較25、37℃下更豐富。這可能是由于在低溫狀態(tài)下，大多數(shù)的細菌生長緩慢，生理代謝受到了抑制，細菌與細菌之間的競爭減弱，沒有因為某種菌的大量生長而造成其他菌的衰弱。這與工商大學薛靜[10]的研究一致，她研究了生制章魚在5、15、25℃的條件下貯藏后腐敗菌菌相變化，結(jié)果表明在5℃下Shannon最大，生物多樣性最高。在老豆腐組中，溫度越高，Shannon值越低。當儲藏溫度升高時，優(yōu)勢菌迅速生長，代謝物質(zhì)積累，抑制了其他菌的生長，微生物多樣性減少。由ACE和Chao1指數(shù)可知，N4、N25、N37樣品的物種豐富度相似，高于NF樣品；而在老豆腐組中，LF和L4樣品物種數(shù)量相當。Coverage值代表各樣本文庫的覆蓋率，測出的值越接近1，表明各樣本覆蓋率越高。8個樣品的覆蓋率均接近1，說明本次測序結(jié)果均能很好地反映樣本的真實情況。

2.4 豆腐在不同溫度儲藏腐敗后的菌相分析

圖3是各個樣品在屬水平上的細菌豐度圖。

圖3 細菌在屬水平上的豐度Fig.3 Abundance of bacteria at the genus level

由圖3可知，芽孢桿菌屬（Bacillus）在內(nèi)酯豆腐中優(yōu)勢明顯，均在90%以上，這與生產(chǎn)工藝有很大關(guān)系。內(nèi)酯豆腐制作過程中有一個保溫成型的過程，絕大部分微生物的營養(yǎng)體在此過程中已死亡，只剩下一些耐熱的芽孢桿菌的芽孢還存活，后期當條件適宜時這些芽孢又會成為營養(yǎng)體繼續(xù)繁殖。而老豆腐在凝固后還需要經(jīng)過擠壓成型和切割的過程，除了加熱后殘留的微生物，還會污染上環(huán)境中的各種微生物，所以其初始菌相比內(nèi)酯豆腐更加復雜。內(nèi)酯豆腐的初始菌相中，約有94%的芽孢桿菌，還有大概5%的菌歸為無法歸類，這可能與選取的基因片段有關(guān)，無法識別一種或多種細菌，猜測可能是一些其他耐熱的細菌，如類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。

內(nèi)酯豆腐中由于大部分不耐熱的腐敗菌已經(jīng)在保溫成型過程中被殺死，極少部分可能由于中心溫度較低，加熱不充分而殘留，這部分細菌在數(shù)量上微乎其微，約占1%以下，再加上生存環(huán)境較嚴苛（密封的豆腐盒中含氧量較少），在后期沒有迅速繁殖起來，且運輸儲藏過程中染菌幾率小，因此芽孢桿菌在內(nèi)酯豆腐的儲藏過程中始終占據(jù)優(yōu)勢地位。由此可推斷，引起盒裝內(nèi)酯豆腐腐敗的主要是耐熱的芽孢桿菌。這與鄧勇[11]、李博[12]等的研究一致。

LF的菌相和內(nèi)酯豆腐很相似，但是由于后續(xù)的工序中污染了環(huán)境中或者包裝中的其他微生物，芽孢桿菌約占80%。在不同的溫度下儲藏腐敗后，其菌相發(fā)生了很大變化。在4℃儲藏腐敗后下，假單胞菌（Pseudomonas）約占 40%，氣單胞菌屬（Aeromonas）約占20%，芽孢桿菌屬（Bacillus）約12%。假單胞菌屬（Pseudomonas）是一種嗜冷菌，盡管在新鮮狀態(tài)下的豆腐中極其微量存在，但是由于它更適應(yīng)低溫環(huán)境，在4℃下有一定程度的增長。假單胞菌產(chǎn)蛋白水解酶能力強，容易在蛋白含量豐富，碳水化合物少的食品中繁殖[13]，在腐敗的冷藏食品中最常見。氣單胞菌（Aeromonas）主要存在于水體，淤泥，土壤和人類糞便中，豆腐中的氣單胞菌可能來源于地面濺起的水或者工人的手。低溫狀態(tài)下，芽孢桿菌繁殖能力很弱。明串珠菌屬在樣品L25和L37中占據(jù)了絕對優(yōu)勢，分別為71%，80%。楊明[14]也同樣在散裝老豆腐中分離鑒定得到了腸膜明串珠菌，反接后證明該菌導致了老豆腐質(zhì)構(gòu)變軟。明串珠菌屬產(chǎn)酸能力強，它的代謝產(chǎn)物使體系的pH值下降，從而抑制了其他菌的生長繁殖。庫特氏菌（Kurthia）在L25和L37兩個樣品中分別占約7%，8%的比例。李除夕[15]對4種不同品牌的豆腐在25℃儲藏腐敗后同樣分離得到兩株庫特氏菌，并認為庫特氏菌屬主要通過產(chǎn)生腐胺引起豆腐的腐敗氣味。L25樣品中不動桿菌（Acinetobacter）約占6%，不動桿菌廣泛分布于外界環(huán)境中尤其是潮濕的環(huán)境，主要在水體和土壤中，粘附力極強，易在各類材料上粘附，不動桿菌極易可能來源于豆腐生產(chǎn)的不銹鋼設(shè)備上，由于接觸造成老豆腐的二次污染。

2.5 Beta多樣性分析

Beta的數(shù)值越接近于0，則表明這樣品間在物種多樣性方面存在的差異越小。樣品間的距離矩陣見表5。

表5 樣品間的距離矩陣Table 5 The distance matrix between samples

由表5可知，不同類型的豆腐的細菌多樣性差異總體上小于同一類型的豆腐。內(nèi)酯豆腐在新鮮狀態(tài)下的物種多樣性與3個溫度下儲藏后的變化相比于簡易包裝老豆腐較小，其 Beta值分別為（0.39、0.16、0.6）和（0.52、0.79、0.83），同時也表明，儲藏溫度越高，老豆腐的細菌多樣性變化也越大，而內(nèi)酯豆腐沒有呈現(xiàn)此規(guī)律，在25℃儲藏下相比于4℃與新鮮的豆腐更為相似。其中，樣品L37和L25最為相似，Beta值只有0.06，除此之外，L37與其他所有樣品的差異均較大，Beta值都超過了0.5。

3 結(jié)論

本研究利用MiSeq高通量測序方法分析了8個豆腐樣品的腐敗菌菌相，基于該技術(shù)對不同溫度儲藏腐敗后的盒裝內(nèi)酯豆腐和簡易包裝老豆腐中菌相進行了比較，結(jié)論如下：引起內(nèi)酯豆腐腐敗變質(zhì)的主要細菌是耐熱的芽孢桿菌屬，而對于簡易包裝的老豆腐，由于生產(chǎn)工藝不同，包裝方式不同，在加工及運輸過程中容易被污染，因此它的初始菌相構(gòu)成更加復雜。老豆腐在不同溫度儲藏腐敗后，與初始菌相差異明顯，其中某些種類的細菌更容易在此條件下繁殖代謝，最終變成優(yōu)勢腐敗菌，而其它種類細菌在后期相互競爭中減少或者消亡。4℃下老豆腐腐敗菌主要有假單胞菌，氣單胞菌，芽孢桿菌，25、37℃儲藏腐敗后明串珠菌屬在數(shù)量上占據(jù)絕對優(yōu)勢。在復雜的食品體系中，微生物之間會通過互惠共生、群體感應(yīng)或者拮抗作用等相互影響，腐敗菌代謝會產(chǎn)粘液、產(chǎn)酸、產(chǎn)腐敗味等，導致顏色、質(zhì)構(gòu)、氣味等顯現(xiàn)出腐敗特性。如果某種細菌具有較強競爭力并且能適應(yīng)此種環(huán)境，它就會大量生長繁殖成為優(yōu)勢菌，其他菌生長受到抑制。

本文僅分析了不同溫度儲藏腐敗后細菌菌相的組成情況，而不同的微生物具體在豆腐的腐敗過程中如何起作用需要進一步探索，這對控制豆腐中腐敗菌生長，延長豆腐的保質(zhì)期有著重要意義。

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The Comparison of Spoilage Microflora of Tofu at Different Storage Temperatures

WU Li-ying，CHENG Yu-liang，GUO Ya-hui，SUN Xiu-lan，QIAN He*
（The School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Studied with boxed lactone tofu and simply packaged firm tofu，including these two kinds of fresh tofus and their spoiled tofu stored at different levels of temperatures（4，25，37 ℃）respectively.Samples were collected for genome extraction and the V3 parts of 16S rRNA of each sample's genome were amplified by PCR.MiSeq high-throughput sequencing technologies was used to analyze the spoilage microflora and bacterial diversity of these two kinds of tofu.The results showed that，the microflora in boxed lactone tofu was less complicated than that in simply packaged firm tofu.The dominant bacteria were Bacillus in boxed lactone tofu and the abundance were all above 90%.In addition，the microbial diversity of the spoiled simply packaged firm tofu stored at 4℃was relatively higher compared to those in the other two simply packaged firm tofu samples.Leuconostoc was the dominant bacteria in spoiled simply packaged firm tofu stored at 25℃and 37℃，accounting for 71%and 80%respectively.Compared to the traditional culture techniques，high-throughput sequencing technologies can reflect bioinformatics which is more closed to the real status of samples.This research can provide some reference about sanitation control for small tofu production enterprises.

boxed lactone tofu；simply packaged firm tofu；high-throughput sequencing；spoilage microflora

2016-12-22

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.037

“十三五”國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0401204）

吳麗櫻（1991—），女（漢），碩士，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

*通信作者