額爾敦巴雅爾，趙鵬宇，焦利衛(wèi)，徐建中，連運河，*

（1.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲057250）

甜葉菊水提物和絮凝上清液成分差異研究

額爾敦巴雅爾1，2，趙鵬宇1，2，焦利衛(wèi)1，2，徐建中1，2，連運河1，2，*

（1.河北省天然色素工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲 057250；2.晨光生物科技集團股份有限公司，河北邯鄲057250）

為詳細了解甜葉菊水提物和絮凝上清液的化學(xué)成分差異，建立超高效液相-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析方法并在此基礎(chǔ)上對兩種樣品成分進行分析比較。研究結(jié)果表明，此方法可有效地將各種化合物分離開來，利用此方法檢測比較得出，甜葉菊水提物和絮凝上清液化學(xué)成分差異顯著，甜葉菊水提物中69種化合物經(jīng)絮凝后上清液中只含有35種化合物。就去除種類而言，絮凝過程去除綠原酸類和去除黃酮類物質(zhì)較為顯著。

超高效液相-串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜；甜葉菊；水提物；絮凝上清液；化學(xué)成分

甜葉菊（Stevia rebaudiana）又稱甜菊、甜草、糖草，為菊科植物，是極好的糖源和營養(yǎng)來源[1]。甜葉菊最主要的價值為甜葉菊葉片中含有的甜菊糖苷，含量達6%～12%，甜菊糖苷具有熱量低、甜度高、味質(zhì)好、耐高溫、穩(wěn)定性好等特點[2]。甜菊糖苷提取方法主要有水浸提法[3-4]、溶劑萃取法[5]、連續(xù)逆流提取法和超聲提取法[6]，它們各有優(yōu)缺點，從生產(chǎn)實際出發(fā)，選擇水作為溶劑浸提，用無毒又廉價的鹽作為絮凝劑，采用離子交換樹脂法進行提取精制。本工藝的第一步為水浸提甜菊葉，水提物中含有大量的水溶性雜質(zhì)，因此需要絮凝來去除水溶性雜質(zhì)。但絮凝工藝去除的成分即水提物與絮凝沉淀上清液化學(xué)成分差異還未見報道，本文就此問題進行分析研究。

甜菊葉水提物及絮凝上清液中成分復(fù)雜，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術(shù)很難將多種成分分離開，僅僅局限于檢測主要糖苷和幾個主要的綠原酸含量[7-8]，而UPLC-QTOFMS技術(shù)在化學(xué)成分分析上有著舉足輕重的作用，其中超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）有著強大的分離作用，是目前分離復(fù)雜成分最有效的方法之一，與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9、3、1.7倍。而超高效液相色譜與四級桿飛行時間質(zhì)譜（Quadrupole time of flight mass spectrometry，QTOF-MS）聯(lián)用對天然產(chǎn)物成分分析起到極大的推動作用，QTOF-MS可在寬質(zhì)量范圍內(nèi)實現(xiàn)高分辨，得到物質(zhì)準確的分子量；能夠獲得真實的同位素峰形分布，得到未知物的分子式，具有高靈敏度、高選擇性以及高效快速的特點[9]。因此本文采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對兩種樣品進行化學(xué)成分差異分析，原有的UPLC方法主要用于檢測甜菊糖的9種糖苷，無法將其它物質(zhì)有效地分離，本文在原有的基礎(chǔ)上，改良UPLC條件，建立UPLC-QTOF-MS分析方法，在此基礎(chǔ)上分析甜葉菊水提物與絮凝上清液兩種樣品的成分差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干燥的甜葉菊葉：內(nèi)蒙；FeSO4、Ca（OH）2：天津市泰興試劑廠；甲酸（HPLC級）、乙腈（HPLC級）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

色譜柱SAgilentPoroshell 120 SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），采用 Acquity UPLC 與 G2 QTOF聯(lián)用系統(tǒng)：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

市面上購買干燥的甜葉菊葉，60℃下進行水提3 h，料液質(zhì)量比為1∶18，過濾得水提物；取1L水提物，在其中加入 9 gFeSO4和 4.5 gCa（OH）2絮凝，絮凝液pH值控制在9.0～10.0，過濾所得上清液干絮凝上清液，將上述水提物和絮凝上清液進行UPLC-QTOF-MS分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為SAgilentPoroshell 120 SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；柱溫 40℃；梯度洗脫溶劑A為0.5%甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫程序如下：20%A（0～2 min），20%～35%A（2 min～20 min），35%A（20 min～25 min），35%～50%A（25 min～35 min），50%～100%A（35 min～45 min），100%A（45 min～48 min），100%～20%A（48 min～48.1 min），20%A（48.1 min～50 min）；流速為 0.4 mL/min；進樣量為 10 μL。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離（ESI）離子源，質(zhì)量掃描范圍（m/z）100～2 000，毛細管電壓為 3 kV（負離子模式），樣品錐電壓40 V，提取錐電壓4 V，源溫110℃，脫溶劑氣溫度300℃，脫溶劑氣流速度700 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-QTOF-MS方法的建立

原有的檢測9種甜菊糖苷的UPLC條件為：色譜柱SAgilentPoroshell 120 SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相為水 ∶乙腈 =68 ∶32；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL；柱溫：40℃。圖1為用于檢測甜菊糖9種糖苷的UPLC條件下的檢測圖譜，可以看出此檢測方法雖可以有效地將9種糖苷分離開來，但其他物質(zhì)的峰較少且不能較好的分離；水提物改良后HPLC圖譜見圖2，如圖2所示，改良后的UPLC條件可以有效地將各種物質(zhì)分離開來。

2.2 甜菊葉水提物化學(xué)成分分析

采用改良后的UPLC分離條件可以有效地將甜菊葉水提物中各化學(xué)成分分離開來，在UPLC-QTOF-MS條件下得到質(zhì)譜圖，通過碎片離子峰及與文獻報道[10-21]比較，共確定得出64種化合物，對化合物進行分類得，甜菊糖類28種、綠原酸類10種、黃酮類12種、氨基酸類5種、其它類物質(zhì)9種。詳細結(jié)果見表1。

圖1 水提物原UPLC檢測圖譜Fig.1 The original UPLC chromatogram of water extract

圖2 水提物改良后UPLC圖譜Fig.2 The improved UPLC chromatogram of water extract

2.3 絮凝上清液化學(xué)成分分析

絮凝上清液UPLC圖譜見圖3。

如圖3所示，采用改良后的UPLC分離條件可以有效地將甜葉菊絮凝上清液中各化學(xué)成分分離開來，在UPLC-QTOF-MS條件下得到質(zhì)譜圖，通過碎片離子峰及與文獻報道[10-21]比較，共確定得出35種化合物，對化合物進行分類得，甜菊糖類19種、綠原酸類4種、黃酮類5種、氨基酸類3種、其它類物質(zhì)4種。詳細結(jié)果見表2。

表1 水提物檢出成分Table 1 The detected components of water extract

續(xù)表1 水提物檢出成分Continue table 1 The detected components of water extract

2.4 水提物與絮凝上清液化學(xué)成分比較

通過對甜葉菊水提物與絮凝上清液的化學(xué)成分比較得出，甜葉菊水提物中檢測到而絮凝上清液中沒有檢測到的物質(zhì)有34種，其中甜菊糖類11種、綠原酸類6種、黃酮類10種、氨基酸類2種，其它類5種，詳細結(jié)果見表3。

表2 絮凝上清液檢出的成分Table 2 The detected components of flocculation supernatant

表3 水提物較絮凝上清液中多檢出成分Table 3 The detected additional components of water extract more than flocculation supernatant

除此之外，絮凝上清液較水提物多檢出成分見表4。

如表4所示，絮凝上清液中所檢測到的物質(zhì)中還有2種甜菊糖類、3種黃酮類共5種化合物在甜菊葉水提物中沒有檢出，因絮凝過程沒有加入有機物，故絮凝上清液中有機成分均來自甜葉菊水提物，因此說明絮凝上清中額外檢出的5種化合物在水提物中檢測時沒有與其它物質(zhì)峰分離開來，此5種物質(zhì)也應(yīng)歸甜葉菊水提物所含成分。

表4 絮凝上清液較水提物多檢出成分Table 4 The detected additional component of flocculation supernatant more than water extract

3 結(jié)論

改良UPLC條件，建立的UPLC-QTOF-MS檢測方法可以有效地將各種化學(xué)成分分離開來，甜葉菊水提物中共發(fā)現(xiàn)化合物64種，絮凝上清液中又多發(fā)現(xiàn)出5種化合物，因此可認為甜葉菊水提物中發(fā)現(xiàn)69種化合物，而絮凝上清液中共發(fā)現(xiàn)35種化合物。甜葉菊水提物與絮凝上清液中相差34種化合物，其中30種甜菊糖類中去除了11種，甜菊糖中9種主要糖苷均未被去除，10種綠原酸類去除了6種，15種黃酮類去除了10種，5種氨基酸類去除了2種。就去除種類而言，絮凝過程去除綠原酸類和去除黃酮類物質(zhì)較為顯著。

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The Study of the Differences of Compositions between Water Extract and Flocculation Supernatant from Stevia rebaudiana

Eerdunbayaer1，2，ZHAO Peng-yu1，2，JIAO Li-wei1，2，XU Jian-zhong1，2，LIAN Yun-he1，2，*
（1.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments，Handan 057250，Hebei，China；2.Chenguang Biotech Group Limited Corporation，Handan 057250，Hebei，China）

An ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLCQTOF-MS）method was developed for more information about the chemical composition differences of stevia extract and flocculation supernatant.The results indicated that the various compounds had been separated effectively by this method.There were 69，35 compounds which were detected in water extract and flocculation supernatant，respectively.The results also indicated that more chlorogenic acid and flavonoids could be removed than other components by flocculation process.

ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOF-MS）；Stevia rebaudiana；water extract；flocculation supernatant；chemical composition

2016-12-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.029

河北省重大科技成果轉(zhuǎn)化專項（16047101Z）

額爾敦巴雅爾（1985—），男（蒙古），博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

*通信作者：連運河（1972—），男（漢），正高級工程師，大專，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。