王 晶，菅盼盼

（1.大連森林動物園，遼寧大連 116013； 2.遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連 116081）

大連市天竺葵葉斑病病情調(diào)查及病原菌鑒定初報*

王 晶1，菅盼盼2

（1.大連森林動物園，遼寧大連 116013； 2.遼寧師范大學生命科學學院，遼寧 大連 116081）

天竺葵（Pelargonium hortorum）具有較高的觀賞價值和藥用價值，是城市園林中常見的草本花卉。近幾年，大連市園林中的天竺葵葉斑病發(fā)生較重，查明病因、為病害防治提供理論依據(jù)尤為重要。采用單斑分離、致病性檢測、形態(tài)學及分子生物學鑒定，查明了大連市天竺葵葉斑病的病原是兩種真菌：枝頂孢屬的點枝頂孢（Acremonium alternatum）和鏈格孢屬的致密鏈格孢（Alternaria compacta）。點枝頂孢侵染天竺葵，導致其發(fā)生葉斑病鮮有報道。

天竺葵；葉斑病；病原菌鑒定

天竺葵（Pelargonium hortorum），屬于多年生草本花卉，世界各地均有種植。其花色艷麗、花期長、產(chǎn)花量大、適應性強，具有較高的觀賞價值。園林中主要用于盆栽觀賞，可室內(nèi)盆栽，也可盆栽后用于花壇、庭院布置，也是很好的插花和干花材料。某些天竺葵可清除空氣中的苯、甲苯等有害物質(zhì)［1］、釋放特殊香氣［2］，具有驅(qū)蚊作用［3］，可以提取精油入藥［4～6］或作為香料［7］，也是一種理想的天然色素原料［8］。近年來大連市區(qū)天竺葵葉片發(fā)生了較為嚴重的葉斑病，查明其發(fā)病原因，為其病害防治提供理論依據(jù)成為當務之急。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病源

于遼寧省大連市森林動物園、勞動公園和西郊生物園，采集天竺葵發(fā)病植株的感病葉片，同時采集健康植株葉片作對照。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

DNA Marker（DL2000）、dNTP、TaqDNA聚合酶、buffer等試劑購于大連 TaKaRa公司；引物（its1和 its4）由上海生工合成；引物合成、DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）等。

1.1.3 儀器

滅菌器（YM100Z）、超凈工作臺（YJ－875）、恒溫培養(yǎng)箱（HH.B11）、光學顯微鏡（OLYMPUS，CX21）、PCR儀（GeneAMP 9700）、凝膠成像系統(tǒng)（GDS8000）等。

1.2 方法

1.2.1 病害調(diào)查及癥狀觀察

于2016年6～10月，選取大連市森林動物園、勞動公園和西郊生物園三地為病害調(diào)查區(qū)，采用五點取樣法在每調(diào)查區(qū)隨機選5點、每點選7株。從發(fā)病初期每隔10 d觀察一次，統(tǒng)計葉斑病發(fā)病率及病情指數(shù)［9］。

1.2.2 病原菌的分離與純化

采用單斑分離法［10］，在病斑的病健交接處剪取約5 mm×5 mm大小的病組織塊，經(jīng)酒精、無菌水表面消毒約2min后，置于PDA培養(yǎng)基中28℃下恒溫培養(yǎng)，3～4 d后觀察菌落生長狀況，計算單斑分離率。再以接種針挑取菌絲尖端，置于PDA培養(yǎng)基中28℃下恒溫培養(yǎng)，重復操作至分離菌純化。

1.2.3 分離菌致病性測定

采用針刺法，依據(jù)科赫氏法則進行分離菌的致病性檢測［9］。每處理接種5片葉，3次重復。

1.2.4 病原菌鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學鑒定

肉眼觀察菌落特征，菌落正反面顏色、輪紋等；光鏡下觀察菌絲及孢子特征，分生孢子的大小、形狀、孢子梗的有無及膈膜等［10］。

1.2.4.2 分子生物學鑒定

以鋼珠法［11］提取致病菌DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，以真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對致病菌rDNA-ITS區(qū)進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程公司進行DNA測序。最后，將測得的DNA序列在 NCBI網(wǎng)站進行 blast比對，利用ClustalX軟件將測得序列與已報道的相近植物病原菌的序列進行序列對齊和同源性序列的多重排定，用 MEGA5.0軟件進行序列分析，鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病情調(diào)查及癥狀觀察

2.1.1 病情調(diào)查

6月中旬植株開始發(fā)病，8月初至9月中旬病害發(fā)展迅速，為發(fā)病盛期，10月份病葉枯萎或枯死。

表1 天竺葵葉斑病發(fā)病率及病情指數(shù)Table1 Incidence and disease index of Geranium Leaf spot disease

2.2.1 癥狀觀察

天竺葵發(fā)病部位為葉片，發(fā)病初期感病部位褪綠變黃，逐漸形成枯斑，最終形成穿孔，病健交接處有明顯的暈圈。隨著病情的蔓延，葉片整片枯死，發(fā)病葉片大多呈現(xiàn)多個病斑，病斑在葉片上分布無規(guī)律性。病斑排列不規(guī)則，有綸紋。葉脈、葉片邊緣處均可見病斑（圖1）。

圖1 天竺葵葉斑病癥狀Figure 1 Symptoms of Geranium leaf spot

2.2 單斑分離率

從天竺葵感病葉片單斑分離出3種不同菌落形態(tài)的真菌，分別命名為E1、E2和E3，他們的單斑分離率分別為46%、40%和14%，對照健康組葉片均無真菌菌落生長。依據(jù)單斑分離率的多少，初步推斷導致天竺葵葉斑病的主要病原菌可能是E1和E2。

2.3 分離菌的致病性檢測

以針刺法分別接種3株真菌，E1和 E2可使天竺葵的健康葉片發(fā)病，發(fā)病率分別為100%和97.8%，而接種E3的健康葉片未見發(fā)?。挥謱⒔臃N發(fā)病的2株菌E1和E2進行混合菌株接種處理，其發(fā)病率是100%。對天竺葵接種發(fā)病葉片重新進行單斑分離、鑒定，其分離菌與接種菌的菌落及分生孢子形態(tài)一致。由此可以斷定E1和E2具有侵染性，是天竺葵葉斑病的致病菌。

2.4 病原菌鑒定

2.4.1 形態(tài)學鑒定

病原菌E1：在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)6 d后，菌落直徑為43 mm。菌落正面為白色至淡粉色，無輪紋，菌絲初期緊湊而濕潤，菌絲細并透明，匍匐生長，菌落反面為淡粉黃色；分生孢子透明，單細胞，倒卵圓形或圓柱狀，分生孢子大小約4.2～5.0×1.5～2.0μm（圖2）。

病原菌E2：在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)6d后，菌落直徑為48mm。菌落正面為墨綠色、有輪紋，菌落表面濕潤，菌落反面為墨綠色至黑色；分生孢子梗直立，分生孢子大多數(shù)倒梨形、近卵狀或倒棒狀，黃褐色至褐色，具有橫隔3～7個，縱、斜隔膜0～4個；分生孢子大小為24.4～48.9μm×7.3～12.2μm，喙及假喙柱狀，淡褐色至近無色，部分假喙延伸較長，2.4～14.7μm×2.4～4.9 μm（圖3）。

依據(jù)分離菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)，其形態(tài)學鑒定結(jié)果為：E1為半知菌亞門（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、叢梗孢目（Moniliales）、淡色菌科（Moniliaceae）、枝頂孢屬（Acremoniumsp.）的點枝頂孢（Acremonium alternatum）；E2為半知菌亞門（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、鏈格孢屬（Alternaria）的致密鏈格孢（Alternaria compacta）。

2.4.2 分子生物學鑒定

兩種致病菌 DNA，以引物 ITS1和 ITS2經(jīng)PCR擴增后，電泳檢測在500 bp左右處，可見DNA純度及濃度較高的特異性條帶。PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，E1序列長度為548 bp，E2序列長度為531 bp。將此序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast比對，其結(jié)果顯示：E1與點枝頂孢（Acremonium strictum）的相似度為99%，所得分值為964；E2與致密鏈格孢（Alternaria compacta）的相似度99%，所得分值最大，為982。分子生物學鑒定結(jié)果進一步確證了形態(tài)學鑒定結(jié)果的正確。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹如圖4和圖5。

圖2 菌株E1的菌落特征及分生孢子形態(tài)Figure 2 Colony morphologies and conidial shape of the pathogen E1

圖3 菌株E2的菌落特征及分生孢子形態(tài)Figure 3 Colony morphologies and conidial shape of the pathogen E2

圖4 菌株E1的rDNA-ITS系統(tǒng)進化樹Figure 4 Neighbor-joining tree constructed from E1 ITS sequences

圖5 菌株E2的rDNA-ITS系統(tǒng)進化樹Figure 5 Neighbor-joining tree constructed from E2 ITS sequences

3 結(jié)論與討論

任何植物，在整個生長發(fā)育過程中，都容易受到各種病原菌的危害。天竺葵的病害主要為葉部病害，有：褐斑病、葉斑病、灰霉病、花腐病、黃萎病、冠腐病，其致病菌分別是天竺葵鏈格孢（Alternaria pelargoniiEll.et EV）、鏈格孢（Alternaria tenuisNees）、灰葡萄孢（Botrytis cinereaPers.）、天竺葵葡萄孢（Botrytis pelargoniiRoed）、輪枝霉（Verticillium albo-atruminkeReinke et Berth.）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）。本研究結(jié)果表明，大連市天竺葵葉斑病的病原菌是點枝頂孢（Acremonium alternatum）和致密鏈格孢（Alternaria compacta）。鏈格孢菌寄主廣泛［12］，可導致不同花卉及農(nóng)作物發(fā)生病害，但點枝頂孢侵染天竺葵導致其發(fā)生葉斑病鮮有報道。明確大連市天竺葵葉斑病的病原菌對于該病的防治尤為重要，可以選擇對環(huán)境友好的苯醚甲環(huán)唑、代森錳鋅等化學殺菌劑，也為篩選病原菌的拮抗菌研制生物農(nóng)藥提供了參考。20世紀70～80年代，生物農(nóng)藥逐漸走入人們的視野，隨著技術(shù)的發(fā)展以及安全意識的提高漸漸受到人們的重視，并以高選擇性、高安全性以及低生態(tài)影響性等成為植保專家學者、工作者的重要研究課題之一。

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Preliminary Report on the Investigation and Identification of Geranium Leaf Spot Pathogens

WANG Jing1，JIAN Pan-pan2
（1．Dalian Forest Zoo，Dalian，Liaoning 116013； 2．College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning 116081）

Geranium（Pelargonium hortorum）is a common herbaceous flower in urban landscape with a high ornamental and medicinal value.In recent years，serious leaf spot appears in Geranium of Dalian.Therefore，it is imperative to find out the pathogenesis and provide theoretical basis for the disease prevention.To identify the pathogens of the leaf spotof Geranium，severalmethodswere used such as isolation pathogens from the leaf spot sample，pathogenicity determination of the isolated strain，morphological and molecular biological evaluation，etc.The results show thatAcremonium alternatumandAlternaria compactaare two kinds of pathogens that lead to the Geranium leaf spot in Dalian.So far，Acremonium alternatumof the Geranium leaf disease is rarely reported.

Geranium；Leaf spot；Pathogen identification

S682.1＋62.01

B

1002－1728（2017）04－0039－05

10.3969／j.issn.1002－1728.2017.04.009

2017－07－14

王晶（1970－），女，從事園林綠化工作。

菅盼盼（1991－），女，研究生（在讀）。