李會(huì)影，王慧智，張子旸（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江牡丹江 157011）

·精準(zhǔn)醫(yī)療·

HPV16陽性和陰性患者宮頸癌組織中miR-27a-3p和HOXB8蛋白的表達(dá)差異及其機(jī)制研究

李會(huì)影＊，王慧智，張子旸#（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江牡丹江 157011）

目的：探討miR-27a-3p和同源盒B8（HOXB8）蛋白在人乳頭瘤病毒16型陽性[HPV16（+）]和陰性[HPV16（－）]患者宮頸癌組織中表達(dá)的差異及其機(jī)制。方法：選取2012年1月－2016年1月于我院就診的宮頸癌患者120例，根據(jù)其是否感染HPV16分為HPV16（+）組（60例）和HPV16（－）組（60例）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表達(dá)水平，采用蛋白印跡法檢測(cè)HOXB8蛋白的表達(dá)水平，采用巢式降落式甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平，采用染色質(zhì)免疫共沉淀-定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平；培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞株，考察轉(zhuǎn)染miR-27a-3p模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor）后miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p的表達(dá)水平顯著低于HPV16（－）組患者，HOXB8 mRNA和蛋白表達(dá)水平、miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平和組蛋白甲基化水平均顯著高于HPV16（－）組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。在SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic后，miR-27a-3p的表達(dá)水平顯著升高，而HOXB8 mRNA的表達(dá)水平顯著降低；轉(zhuǎn)染miR-27a-3p inhibitor后，miR-27a-3p的表達(dá)水平顯著降低，而HOXB8 mRNA的表達(dá)水平則顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：HPV16可能通過啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化下調(diào)miR-27a-3p的表達(dá)，從而影響宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，HOXB8蛋白可能是其作用靶點(diǎn)。

人乳頭瘤病毒16型；宮頸癌；miR-27a-3p；同源盒B8蛋白；DNA甲基化；組蛋白甲基化

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和病死率均較高，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1-2]。人乳頭瘤病毒16型（Human papilloma virus type 16，HPV16）是最普遍、最致命的HPV類型之一，也是誘發(fā)宮頸癌的主要原因[3]。同源盒B8（Homeobox B8，HOXB8）是HOX蛋白家族成員，其表達(dá)水平在HPV16陽性[HPV16（+）]宮頸癌組織中顯著升高，但具體機(jī)制尚未闡明[4]。微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)[5]。研究表明，多種miRNAs通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展，其中miR-27a-3p可調(diào)控HOXB8基因的表達(dá)[6-8]?，F(xiàn)有研究多集中于miRNAs的調(diào)控作用，而忽視了miRNAs表達(dá)變化的機(jī)制。DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式[9-10]，其是否參與miRNAs的表達(dá)調(diào)控仍不清楚。因此，本研究以HPV16（+）和HPV16陰性[HPV16（－）]宮頸癌患者為研究對(duì)象，探討miR-27a-3p的表達(dá)變化及其機(jī)制，并考察其對(duì)HOXB8蛋白是否具有調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 QuantStudio Q3型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）；Mastercycler Nexus Eco型普通PCR儀、547R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Powerpac HV Power Supply型電泳儀（美國BioRad公司）；FCM型凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司）；DLHR-D1603型電動(dòng)勻漿器（華鄰科技有限公司）；HR900-ⅡA2型生物安全柜（海爾生物醫(yī)療）。

1.1.2 試劑 胎牛血清（FBS）、opti-MEM無血清培養(yǎng)基、青鏈霉素和高糖培養(yǎng)基（DMEM）（美國Gibco公司，批號(hào)分別為12483-012、51985042、15240-062、12491-015）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國Hyclone公司，批號(hào)：SH30256.01B）；聚山梨酯20（美國BioRad公司，批號(hào)：170-6531）；DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（含SYBR Green、ddH2O）（美國Qiagen公司，批號(hào)分別為69506、74104、204054）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及發(fā)光液（美國ThermoFisher公司，批號(hào)分別為K1691、32106）；DNA甲基化修飾試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：D5030）；miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA熒光定量PCR試劑盒、miR-27a-3p及U6引物（天根生化科技有限公司，批號(hào)分別為DP501、KR201-02、FP401-02、CD201-0025、CD201-0145）；蛋白質(zhì)提取及定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)分別為KGP250、KGPBCA、KGP101）；anti-HOXB8、anti-H3K9me2（美國Abcam公司，批號(hào)分別為ab125727、ab120）；anti-β-actin及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為TA-09、SC-2048）；人工合成miR-27a-3p模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）及陰性對(duì)照（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipo2000（美國Invitrogen公司，批號(hào)：11668027）；染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒[含蛋白A/G瓊脂糖（Protein G Agarose），美國Millipore公司，批號(hào)：17-371]；普通引物由華大基因提供，HOXB8、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物及甲基化特異性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；人宮頸癌細(xì)胞系Si-Ha細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。

1.2 研究對(duì)象

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）于我院首次就診或接受治療的宮頸癌患者，經(jīng)組織活檢及術(shù)后病理學(xué)檢查確診為宮頸癌；（2）既往無其他惡性腫瘤病史；（3）不合并其他惡性腫瘤；（4）術(shù)前未接受放療、化療或其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≤18歲者；（2）妊娠期婦女；（3）嚴(yán)重的肝腎功能障礙者；（4）合并不能有效控制的高血壓、糖尿病及心臟疾病等。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

本研究共納入2012年1月—2016年1月于我院婦產(chǎn)科就診的宮頸癌患者120例，根據(jù)其是否感染HPV16分為HPV16（+）組和HPV16（－）組。其中，HPV16（+）組患者60例，年齡28～63歲，平均年齡（47.2±9.5）歲；HPV16（－）組患者60例，年齡25～59歲，平均年齡（45.7±8.3）歲。所有患者均留取手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本，于－80℃凍存，備用。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-27a-3p和HOXB8 mRNA的表達(dá)水平 按照試劑盒說明書提取宮頸癌組織中的總miRNA和總mRNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。其中，總miRNA的逆轉(zhuǎn)錄分為加多聚腺苷酸（PolyA）尾和逆轉(zhuǎn)錄兩部分。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，反應(yīng)體系包括cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Green 12.5 μL，ddH2O 8.9 μL，共25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線分析。HOXB8基因上游引物：5′-GTCCCTGCGCCCCAATTATTA-3′，下游引物：5′-GCCCGTGGTAGAACTCCTG-3′。HOXB8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平以GAPDH的表達(dá)水平為參照，根據(jù)目的基因的相對(duì)表達(dá)量＝2－ΔΔCt計(jì)算結(jié)果，ΔΔCt＝[CtHOXB8－CtGAPDH]，計(jì)算HOXB8 mRNA的相對(duì)表達(dá)變化。miR-27a-3p相對(duì)表達(dá)水平以U6的表達(dá)水平為參照，根據(jù)目的基因的相對(duì)表達(dá)量＝2－ΔΔCt計(jì)算結(jié)果，ΔΔCt＝[CtmiR-27a-3p－CtU6]，計(jì)算miR-27a-3p的相對(duì)表達(dá)變化。式中，Ct（Cycle threshold）表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.3.2 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測(cè)HOXB8蛋白的表達(dá)水平 將宮頸癌組織剪碎，冰上勻漿，以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，棄去上清，收集沉淀。按照蛋白提取試劑盒說明書提取宮頸癌組織的總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量。按體積比1∶4加入蛋白上樣緩沖液混勻，于100℃下反應(yīng)5 min，使蛋白變性。取變性后的蛋白樣品5 μL，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，切取大小約為32 kDa（HOXB8）和43 kDa（β-actin）的片段，分別進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，采用5%脫脂奶粉對(duì)聚偏二氟乙烯膜（PVDF）封閉2 h。分別與anti-HOXB8和anti-β-actin混合后，于4℃下孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液-聚山梨酯（PBST，由PBS和聚山梨酯20配制）洗膜后，與HRP標(biāo)記的二抗于室溫下孵育2 h，PBST洗膜后加發(fā)光液，于凝膠成像分析儀上成像并分析條帶灰度值。以β-actin的表達(dá)量為參照，計(jì)算HOXB8蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。HOXB8蛋白的相對(duì)表達(dá)水平＝HOXB8灰度值/βactin灰度值。

1.3.3 巢式降落式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）法檢測(cè)miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平 按照試劑盒說明書提取宮頸癌組織的基因組DNA，并采用亞硫酸氫鹽法對(duì)基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。在Ensembl Genome Browser（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）中查找miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)序列并線上設(shè)計(jì)1對(duì)外引物和2對(duì)內(nèi)引物（即甲基化引物和非甲基化引物）。外引物上游：5′-GGTTTTGTGTAGGGGAAATTTTATAG-3′，外引物下游：5′-CAACCCTATCCCCTTAAAATCTAAA-3′；甲基化引物上游：5′-TTGGGGTGAGATTATTTTTTTATTC-3′，甲基化引物下游：5′-CTAAAACCTAACTATACCCTCCGTT-3′；非甲基化引物上游：5′-GGGGTGAGATTATTTTTTTATTTGT-3′，非甲基化引物下游：5′-CTAAAACCTAACTATACCC-TCCATT-3′。外引物擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降0.5℃至52℃，72℃再延伸7 min。以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，繼續(xù)進(jìn)行內(nèi)引物的擴(kuò)增，其擴(kuò)增反應(yīng)條件同外引物。取PCR產(chǎn)物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，并于凝膠成像分析系統(tǒng)成像，計(jì)算甲基化條帶及非甲基化條帶的光密度（OD），miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平＝甲基化條帶的OD值/（甲基化條帶的OD值+非甲基化條帶的OD值）。

1.3.4 染色質(zhì)免疫共沉淀-定量PCR（CHIP-qPCR）法檢測(cè)miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平 將宮頸癌組織冰上勻漿后，以終體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醛室溫固定10 min。采用終濃度為0.125 mol/L甘氨酸作用5 min以終止交聯(lián)。以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min后，棄去上清，PBS沖洗2遍。SDS裂解液重懸并裂解組織沉淀，冰上進(jìn)行超聲破碎操作，使DNA破碎為100～1 000 bp大小的片段。以離心半徑6 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min后取上清液100 μL，加入anti-H3K9me2抗體，于4℃下孵育過夜，形成anti-H3K9me2-H3K9me2復(fù)合物；經(jīng)蛋白A/G瓊脂糖結(jié)合沉淀后，形成Protein G Agarose-anti-H3K9me2-H3K9me2復(fù)合物，于65℃水浴中解除交聯(lián)，并采用DNA提取試劑盒、按說明書操作純化DNA，以純化后的DNA為模板，對(duì)miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件同“1.3.1”項(xiàng)，退火溫度為59℃。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%FBS及1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)SiHa細(xì)胞株。按每孔1×106個(gè)細(xì)胞鋪板：①取100 μL opti-MEM與適量Lipo2000混勻靜置5 min；②另取100 μL opti-MEM與適量miR-27a-3p mimic、inhibitor或陰性對(duì)照混勻靜置5 min；③將上述①②混勻后靜置20 min，加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，于48 h后收集細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，步驟同“1.3.1”項(xiàng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用Students’t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p表達(dá)水平比較

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p的表達(dá)水平顯著低于HPV16（－）組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見圖1。

2.2 兩組患者宮頸癌組織中HOXB8 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較

圖1 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p表達(dá)水平比較Fig 1 Comparison of the expression of miR-27a-3p in cervical cancer tissue between 2 groups

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中HOXB8 mRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著高于HPV16（－）組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖2。

2.3 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較

圖2 兩組患者宮頸癌組織中HOXB8 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較Fig 2 Comparison of the expression of HOXB8 mRNA and protein in cervical cancer tissues between 2 groups

在線（http：//www.urogene.org/methprimer/）查看miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)和CpG島分布情況，結(jié)果顯示，miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)富含CpG島，詳見圖3。

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平顯著高于HPV16（－）組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見圖4、圖5。

圖3 miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)和CpG島分布情況Fig 3 Distribution of CpG islands and CpG sites in miR-27a-3p promoter region

2.4 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平比較

圖4 nMS-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 4 Electrophoretogram of nMS-PCR product

圖5 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平比較Fig 5 Comparison of DNA methylation levels of miR-27a-3p promoter region in cervical cancer tissues between 2 groups

HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平顯著高于HPV16（－）組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖6。

2.5 miR-27a-3p對(duì)HOXB8表達(dá)的影響

在人宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞株中分別轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic和inhibitor后，檢測(cè)miR-27a-3p和HOXB8 mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，在SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic后，miR-27a-3p的表達(dá)水平顯著升高，而HOXB8 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染miR-27a-3p inhibitor后，miR-27a-3p的表達(dá)水平顯著降低，而HOXB8 mRNA的表達(dá)水平則顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），詳見圖7。

圖6 兩組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)組蛋白甲基化水平比較Fig 6 Comparison of histone methylation levels of miR-27a-3p promoter region in cervical cancer tissues between 2 groups

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，HPV感染是引起宮頸癌的主要原因之一。HPV是一種雙鏈DNA病毒，低危險(xiǎn)性HPV可引起良性的生殖器疣，而高危險(xiǎn)性HPV與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。其中，HPV16是HPV最常見的類型，是導(dǎo)致宮頸癌的重要因素[3，11-12]。本研究以HPV16（+）和HPV16（－）宮頸癌患者為研究對(duì)象，初步探討HPV16的致病機(jī)制。

圖7 miR-27a-3p對(duì)HOXB8表達(dá)的影響Fig 7 Effect of miR-27a-3p on the expression of HOXB8

3.1 HOXB8與miRNAs

HOXB8是同源盒家族成員，能夠編碼具有HOX DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核蛋白。研究表明，HOXB8與結(jié)直腸癌、胃癌和宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4，13-14]。本研究結(jié)果顯示，在HPV16（+）宮頸癌患者組織中HOXB8的表達(dá)水平顯著升高，與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致，但其具體機(jī)制尚不清楚。miRNAs是一類大小約為18～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，可通過結(jié)合靶mRNA 3′-非翻譯（UTR）區(qū)使其降解或翻譯一致，從而實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的目的。Yang H等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-497可靶向轉(zhuǎn)酮酶調(diào)控宮頸癌對(duì)鉑化療的敏感性；Zhou N等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-138可通過調(diào)控人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的表達(dá)水平抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；Lai XJ等[17]研究表明，miR-421可通過下調(diào)Bcl-xL從而介導(dǎo)c-33a宮頸癌細(xì)胞的凋亡，這提示多種miRNAs可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，在人宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染miR-27a-3p mimic（即過表達(dá)miR-27a-3p）后，HOXB8 mRNA的表達(dá)水平顯著降低；而轉(zhuǎn)染miR-27a-3p inhibitor（即抑制miR-27a-3p的表達(dá)）后，HOXB8 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，提示miR-27a-3p可能直接或間接靶向調(diào)控HOXB8的表達(dá)，但具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

3.2 miRNAs與表觀遺傳學(xué)修飾

以往研究多集中于miRNAs對(duì)其靶基因的調(diào)控作用，而忽視了miRNAs表達(dá)變化的機(jī)制。表觀遺傳學(xué)修飾是指在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生可逆、可遺傳的改變。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation）、組蛋白甲基化（Histone methylation）、基因組印記（Genomic imprinting）、母體效應(yīng)（Maternal effects）、基因沉默（Gene silencing）、核仁顯性、休眠轉(zhuǎn)座子啟動(dòng)和RNA編輯（RNAediting）等[18]。其中，DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式，文獻(xiàn)報(bào)道DNA甲基化和H3K9me2均為基因沉默的標(biāo)志，且二者可能具有協(xié)同調(diào)控基因表達(dá)的作用[9，19]。趙麗等[20]研究表明，miR-124啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。然而，DNA甲基化和組蛋白甲基化是否參與HPV16（+）宮頸癌組織miR-27a-3p的表達(dá)調(diào)控仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，HPV16（+）組患者宮頸癌組織中miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)DNA和組蛋白甲基化水平均顯著高于HPV16（－）組患者，提示DNA甲基化和組蛋白甲基化參與了HPV16（+）宮頸癌組織中miR-27a-3p的表達(dá)調(diào)控。DNA甲基化和組蛋白甲基化的發(fā)生需要相應(yīng)酶的催化，如DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）、組蛋白甲基化酶G9a等，但其在HPV16（+）宮頸癌中是否發(fā)生改變尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，HPV16可能通過啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化下調(diào)miR-27a-3p的表達(dá)，從而影響宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展；HOXB8蛋白可能是其作用靶點(diǎn)，HOXB8基因可能是miR-27a-3p的靶基因。本研究為HPV16（+）宮頸癌患者的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。但miR-27a-3p啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生DNA甲基化和組蛋白甲基化的機(jī)制仍不明確，還需后續(xù)深入研究。

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（編輯：張?jiān)拢?/p>

Expression Difference and Its Mechanism Study of miR-27a-3p and HOXB8 Protein in Cervical Cancer Tissues of HPV16-positive and HPV16-negative Patients

LI Huiying，WANG Huizhi，ZHANG Ziyang（Dept.of Obstetrics and Gynecology，Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College，Heilongjiang Mudanjiang 157011，China）

OBJECTIVE：To investigate the expression difference and its mechanism of miR-27a-3p and HOXB8 protein in cervical cancer tissues of HPV16-positive and HPV16-negative patients.METHODS：A total of 120 patients with cervical cancer in our hospital during Jan.2012-Jan.2016 were divided into HPV16-positive group（60 cases）and HPV16-negative group（60 cases）according to HPV16 infection situation.The expression of miR-27a-3p mRNA and HOXB8 mRNA in cervical cancer tissue were detected by RT-qPCR.The expression of HOXB8 protein was detected by Western blotting assay.DNA methylation level of miR-27a-3p promoter region was detected by nested-down methylation specific PCR（nMS-PCR）.Histone methylation level of miR-27a-3p promoter region was detected by chromatin immunoprecipitation PCR（CHIP-PCR）.The expression of miR-27a-3p mRNA and HOXB8 mRNA were detected after transfecting miR-27a-3p mimic and inhibitor into Human cervical cancer cell line SiHa，respectively.RESULTS：The expression of miR-27a-3p in HPV16-positive group was significantly lower than HPV16-negative group，while HOXB8 mRNA and protein expression，DNA and histone methylation levels of miR-27a-3p promoter region were significantly higher than HPV16-negative group，with statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.After transfecting miR-27a-3p mimic into SiHa cells，the expression of miR-27a-3p was increased significantly，while that of HOXB8 mRNA was decreased significantly；after miR-27a-3p inhibitor transfection，the expression of miR-27a-3p was decreased significantly，while that of HOXB8 mRNA was increased significantly，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：HPV16 may down-regulate the expression of miR-27a-3p through DNA methylation and histone methylation of promoter region，so as to influence the generation and development of cervical cancer.HOXB8 may be the target protein of miR-27a-3p.

Human papilloma virus type 16；Cervical cancer；miR-27a-3p；Homeobox B8 protein；DNA methylation；Histone methylation

R711.74

A

1001-0408（2017）23-3169-06

2016-12-22

2017-06-15）

＊副主任醫(yī)師，碩士。研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)。電話：0453-6602036。E-mail：huiying26@163.com

#通信作者：副主任醫(yī)師。研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)。電話：0453-6602036。E-mail：1403355759@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.23.01