王蕊

摘要：本文主要針對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分析，明確了在發(fā)酵的過(guò)程中葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)的研制方法。從發(fā)酵的需求出發(fā)，針對(duì)葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)的研究的需求以及研發(fā)的過(guò)程中的思路和具體的方法進(jìn)行總結(jié)，希望能夠?yàn)榻窈蟮钠咸烟前l(fā)酵在線檢測(cè)系統(tǒng)的研發(fā)和應(yīng)用帶來(lái)參考。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵過(guò)程，葡萄糖，在線檢測(cè)提供

前言

在發(fā)酵的過(guò)程中，很多時(shí)候?qū)ζ咸烟切枰M(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，所以我們必須要研究葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)，目的在于進(jìn)一步的分析葡萄糖的數(shù)量以及在應(yīng)用的過(guò)程中需要關(guān)注的要點(diǎn)，只有這樣才能夠真正的檢測(cè)到位。

1、葡萄糖是發(fā)酵過(guò)程概述

發(fā)酵工程是生化工程和現(xiàn)代生物技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，隨著發(fā)酵技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)發(fā)酵過(guò)程測(cè)控系統(tǒng)的要求也越來(lái)越高。然而，生物發(fā)酵過(guò)程機(jī)理復(fù)雜，具有高度的非線性、時(shí)變性，發(fā)酵過(guò)程中的生物參量是關(guān)鍵的過(guò)程參量，由于受其測(cè)量水平的限制，難以實(shí)現(xiàn)在線測(cè)量，導(dǎo)致先進(jìn)控制方法只能停留在理論探討上，難以在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)用。

至今為止，生物反應(yīng)過(guò)程控制依賴于pH值、溫度（T）、紫外線（OD）等傳感器測(cè)得的少數(shù)物理參數(shù)，由控制專家經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)建模對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行過(guò)程曲線擬合，對(duì)生物反應(yīng)體系而言，就是在線分析檢測(cè)。在線調(diào)控主要受制于生化反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，易造成生化反應(yīng)中生物信息無(wú)法及時(shí)得到。復(fù)雜性體現(xiàn)在：（1）菌體生長(zhǎng)和代謝的機(jī)制模糊以及發(fā)酵系統(tǒng)所包含的參數(shù)多，且為時(shí)間函數(shù)；往往包含氣、液、固三相體系；（2）發(fā)酵系統(tǒng)經(jīng)常要求保持無(wú)菌，高溫滅菌會(huì)嚴(yán)重破壞生物傳感器生物活性物質(zhì)如酶的活性；發(fā)酵時(shí)pH、溫度等條件與生物傳感器上酶測(cè)定條件不符造成的測(cè)量偏差；發(fā)酵液的底物濃度往往超出傳感器線性范圍；（3）膜長(zhǎng)期與底物接觸活性下降，使電極壽命縮短等。因此，在生化反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)生物、化學(xué)量的分析系統(tǒng)尚未見(jiàn)報(bào)道。

葡萄糖是發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的主要碳源，但必須控制其在發(fā)酵液中的濃度。在發(fā)酵前期，如果葡萄糖濃度過(guò)高，容易對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用；在發(fā)酵后期，如果葡萄糖濃度過(guò)低，則會(huì)限制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。需特別注意的是流加的葡萄糖量，即使是超出最適濃度范圍的微小波動(dòng)都將引起嚴(yán)重的阻遏或限制。在發(fā)酵過(guò)程中，為了防止染菌，發(fā)酵罐等設(shè)備需要經(jīng)過(guò)高溫蒸氣滅菌，這會(huì)導(dǎo)致常用的“酶膜式”葡萄糖生物傳感器所用的生物酶的活性下降或喪失。因此，葡萄糖濃度一般都通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室離線化驗(yàn)取樣樣本獲得。依據(jù)測(cè)定結(jié)果實(shí)施間歇式的補(bǔ)料，而間歇式補(bǔ)料容易引起糖濃度的劇烈變化，造成罐內(nèi)環(huán)境（如滲透壓）不穩(wěn)定，從而對(duì)菌體代謝活性及最終發(fā)酵生產(chǎn)帶來(lái)負(fù)面影響，進(jìn)而影響發(fā)酵的產(chǎn)率和質(zhì)量。因此，葡萄糖在線測(cè)量?jī)x器的研制具有重要意義。

與常見(jiàn)葡萄糖檢測(cè)方法，如菲林滴定法、氧化酶-偶聯(lián)比色法（GOD-POD法）、氣相色譜法、高效液相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜法相比，葡萄糖氧化酶-電極法具有特異性強(qiáng)、適于在線、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。因此，以葡萄糖氧化酶-電極法為原理的葡萄糖酶電極生物傳感器（以下簡(jiǎn)稱為葡萄糖生物傳感器）及以葡萄糖生物傳感器為核心部件的葡萄糖分析儀均得到了廣泛地研究與應(yīng)用。例如，美國(guó)YSI公司的YSI2300STATPLUS葡萄糖乳酸分析儀、德國(guó)EKF公司的BIOSENC_Line葡萄糖/乳酸分析儀和中國(guó)山東省科學(xué)院生物研究所研制的SBA系列生物傳感分析儀，均采用“酶膜”方式葡萄糖生物傳感器，主要用于醫(yī)療血糖及發(fā)酵工業(yè)葡萄糖的離線測(cè)量，由于酶的生物活性經(jīng)高溫滅菌會(huì)失活，因此“酶膜”方式葡萄糖生物傳感器不能與發(fā)酵罐直接連接，導(dǎo)致不能在線使用。瑞典ChemelAB公司的SIRE系列葡萄糖分析儀，采用“識(shí)別物質(zhì)注射”方式葡萄糖生物傳感器，主要用于食品、發(fā)酵工業(yè)葡萄糖的離線測(cè)量。該生物傳感器采用的探頭方式，通過(guò)透析膜將傳感器與待測(cè)液隔開(kāi)。如果將探頭插入發(fā)酵罐中，注射的酶液、流入的緩沖液以及酶促反應(yīng)后的廢液將會(huì)污染發(fā)酵液，因此不能直接插入發(fā)酵罐中進(jìn)行葡萄糖濃度的在線測(cè)量。而Min等利用在線FIA結(jié)合微透析取樣和雙生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵過(guò)程葡萄糖和L-乳酸的同時(shí)監(jiān)測(cè)。

2、發(fā)酵過(guò)程葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)的研制

本研究構(gòu)建了發(fā)酵過(guò)程的葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)（以下簡(jiǎn)稱為檢測(cè)系統(tǒng)）。其中，研制的新型酶注射式葡萄糖生物傳感器，能夠承受高溫蒸氣滅菌，并因采用“新鮮”酶液，而不用頻繁校準(zhǔn)，其對(duì)葡萄糖的靈敏度達(dá)到0.259nA/（mg/L）；檢出限為0.7mg/L。對(duì)于500mg/L葡萄糖濃度測(cè)量結(jié)果CV值為2.02%；自行設(shè)計(jì)的透析取樣系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)系統(tǒng)的在線取樣，同時(shí)減少了待測(cè)液的消耗。通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，驗(yàn)證了此檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用于葡萄糖濃度在線測(cè)量的可行性。

2.1儀器與試劑

SBA-40E葡萄糖生物傳感分析儀（山東省科學(xué)院生物研究所）。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，來(lái)自山東省科學(xué)院生物研究所。磷酸鹽緩沖液，由山東省科學(xué)院生物研究所SBA系列分析儀專用緩沖劑添加蒸餾水配制。葡萄糖氧化酶液，由葡萄糖氧化酶（型號(hào)G7141，312U/mg，美國(guó)Sigma公司）添加磷酸鹽緩沖液配制。

2.2葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)

本研究構(gòu)建的葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示。系統(tǒng)主要由透析取樣系統(tǒng)、酶液定量注射裝置、酶注射式葡萄糖生物傳感器、三電極檢測(cè)電路（即恒電位儀電路）和DSP數(shù)據(jù)采集電路等組成。

系統(tǒng)工作過(guò)程如下：首先透析取樣探頭從待測(cè)場(chǎng)合（如發(fā)酵罐）中提取待測(cè)液（如發(fā)酵液），并通過(guò)待測(cè)液定量注射裝置將待測(cè)液定量注射入酶注射式葡萄糖生物傳感器。與此同時(shí)，酶液定量注射裝置也將定量的葡萄糖氧化酶注射入傳感器。葡萄糖與葡萄糖氧化酶在三電極檢測(cè)電路系統(tǒng)作用下發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)生與待測(cè)液中葡萄糖濃度成比例的電流信號(hào)。電流信號(hào)經(jīng)過(guò)DSP數(shù)據(jù)采集電路和上機(jī)位采集并存儲(chǔ)。

2.3酶注射式葡萄糖生物傳感器

發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖的在線檢測(cè)要求所使用的檢測(cè)系統(tǒng)能夠承受在線的高溫蒸氣滅菌。因而研制了耐高溫的新型酶注射式葡萄糖生物傳感器，其作為檢測(cè)系統(tǒng)的核心部件，采用了非固定化酶方式[12，20]。酶注射式葡萄糖生物傳感器的結(jié)構(gòu)如圖2A所示。其中三電極裝置的工作電極、對(duì)電極和參比電極分別采用Pt，Ag和Ag/AgCl電極制成，而反應(yīng)池的外結(jié)構(gòu)體及電極體均采用耐高溫的PEEK材料制成。

酶注射式葡萄糖生物傳感器使用的是外來(lái)注射的酶液，而非傳統(tǒng)的需安裝在電極表面的酶膜，即所研制的傳感器本身不含具有生物活性的酶。另外，所研制的傳感器和透析取樣系統(tǒng)所用材料均耐高溫，因此檢測(cè)系統(tǒng)可以始終保持與待測(cè)場(chǎng)合（如發(fā)酵罐）相連接，即使待測(cè)場(chǎng)合（如發(fā)酵罐）的溫度很高時(shí)，對(duì)此傳感器也無(wú)損害和影響，故可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜過(guò)程（如發(fā)酵過(guò)程）下葡萄糖濃度的在線測(cè)量。

3、結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖在線檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用也是非常重要的，在應(yīng)用這些檢測(cè)系統(tǒng)的時(shí)候要更好地明確其應(yīng)用流程，并且積極總結(jié)應(yīng)用過(guò)程中存在的問(wèn)題，及時(shí)的進(jìn)行改進(jìn)和完善。

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