段文武　蔣祖豐　伍芬桂

摘要 以蝴蝶蘭大紅袍花梗經(jīng)誘導(dǎo)萌發(fā)生成的叢生芽為試驗材料，對培養(yǎng)溫度、活性炭、椰子汁和轉(zhuǎn)接周期4個因素設(shè)置正交試驗，比較不同處理對叢生芽增殖過程中抑制褐化的效果，篩選出抑制褐化的最優(yōu)方法，為其工廠化生產(chǎn)提供理論參考。結(jié)果表明，活性炭能顯著抑制褐化且對褐化的影響最大，各因素對褐化影響效應(yīng)大小排序為活性炭>轉(zhuǎn)接周期>溫度>椰子汁；活性炭1.0 g/L、轉(zhuǎn)接周期10 d、溫度25 ℃、椰子汁濃度150 mL/L為抑制褐化的最優(yōu)處理。

關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭；組織培養(yǎng)；褐化抑制；活性炭

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）14-0137-02

Abstract To provide theoretical reference for the factory production，used shoots induced from pedicels germination of Phalaenopsis amabilis Big Red Robe as experimental material，culture temperature，concentration of AC，coconut juice concentration and switching cycle were set up to carry out the orthogonal test，and effect of different treatment on the inhibition of tissue-browning effect of the proliferation of cluster buds was compared to screen the optimal method to inhibit tissue-browning.The results showed that AC could significantly inhibit browning and had the greatest influence on browning.The effects of various factors on the browning effect were sorted by the AC concentration>switching cycle>temperature>coconut juice concentration.The optimum treatment for browning inhibition was AC 1.0 g/L，switching cycle 10 d，temperature 25 ℃ and coconut juice concentration 150 mL/L.

Key words Phalaenopsis amabilis；tissue culture；inhibition of tissue-browning；active carbon

蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）為蘭科（Orchidaceae）蝴蝶蘭屬（Phalaenopsis）植物，因花形似蝶而得名[1]。其花形奇特、花色艷麗、花期持久，素有“蘭中皇后”之美譽，極具觀賞價值和經(jīng)濟價值，在國內(nèi)外花卉市場上深受歡迎[2]。蝴蝶蘭屬于氣生根植物，喜高溫高濕和半陰環(huán)境，原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶雨林地區(qū)，在我國臺灣和東南亞等地均有分布[3]。由于蝴蝶蘭屬于單莖性氣生蘭，在自然條件下很難進行分株繁殖；且種子因發(fā)育不完全而極難萌發(fā)[4]，難以滿足日益增長的市場需求，所以目前生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的繁殖方式主要是組織培養(yǎng)[5]。在蝴蝶蘭組培過程中，培養(yǎng)材料褐化很常見，一直是蝴蝶蘭組培快繁中困擾人心的問題。本研究在前人報道的基礎(chǔ)上，以蝴蝶蘭大紅袍花梗經(jīng)誘導(dǎo)萌發(fā)生成的叢生芽為試驗材料，比較不同處理對叢生芽增殖過程中抑制褐化的效果，篩選出抑制褐化的最優(yōu)處理，以期為蝴蝶蘭大紅袍組培工廠化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用蝴蝶蘭大紅袍花梗經(jīng)誘導(dǎo)萌發(fā)生成的長約2 cm且生長勢一致的叢生芽作為試驗材料。

1.2 試驗方法

試驗所有處理均采用B5基本培養(yǎng)基，附加6-BA 5.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L、蔗糖20 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH值5.6。培養(yǎng)環(huán)境光照16 h/d，光強1 500～2 000 lx，濕度65%左右。

本試驗對培養(yǎng)溫度、活性炭、椰子汁和轉(zhuǎn)接周期4個因素各設(shè)置3個水平，進行L9（34）正交試驗（表1、2）。每瓶接種1個芽，每個處理接種20瓶，3次重復(fù)。接種30 d后統(tǒng)計褐化抑制率。

1.3 統(tǒng)計方法

褐化率（%）=褐化芽數(shù)/（接種芽總數(shù)-污染芽數(shù)）×100；

褐化抑制率（%）=1-褐化率。

用Excel進行原始數(shù)據(jù)的處理，用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進行其他相關(guān)的分析。

2 結(jié)果與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)直觀分析、方差分析及Duncan多重比較（表3、4、5），結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度、活性炭、椰子汁和轉(zhuǎn)接周期4個因素對蝴蝶蘭組培褐化均有影響?；钚蕴磕茱@著抑制褐化的發(fā)生，且對褐化的影響最大。轉(zhuǎn)接周期對褐化的影響次之，且縮短轉(zhuǎn)接周期能顯著抑制褐化的發(fā)生。培養(yǎng)溫度在20～25 ℃之間時褐化程度明顯輕于30 ℃時，說明低溫能有效抑制褐化的發(fā)生。椰子汁對抑制褐化也有一定的作用。這4個因素的抑制褐化效應(yīng)大小排序為活性炭>轉(zhuǎn)接周期>溫度>椰子汁。

根據(jù)同一因素不同水平的差異顯著性比較，可得出A1B2C2D1、A1B2C2D2、A2B2C2D1和A2B2C2D2這4個處理抑制褐化的效果明顯好于其他處理。在因素A（培養(yǎng)溫度）和D（轉(zhuǎn)接周期）水平取值上，考慮工廠化生產(chǎn)條件和成本因素，當以取值A(chǔ)2和D2為好。因此，A2B2C2D2處理為抑制褐化的最優(yōu)處理，即培養(yǎng)溫度25 ℃、活性炭1.0 g/L、椰子汁濃度150 mL/L、轉(zhuǎn)接周期10 d。endprint

3 討論

近年來，前人[6-7]對植物組培中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象進行了大量的研究，認為褐化的發(fā)生主要是由于刀片傷害切口處細胞，受傷細胞分泌多酚氧化酶（PPO）作用于天然底物酚類物質(zhì)形成褐色的醌類物質(zhì)，擴散到培養(yǎng)基中，抑制其他酶活性，毒害整個外植體。褐化程度與培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)接周期、吸附劑和有機添加物等因素具有很大的關(guān)系。適當?shù)臏囟?、適時轉(zhuǎn)接、適宜的吸附劑和有機添加物等因素結(jié)合起來可以有效地減輕褐化對植物組培的影響。培養(yǎng)溫度對褐化的影響較大，高溫能促進PPO的活性，促進酚類物質(zhì)氧化形成醌類物質(zhì)，增加褐化程度，而低溫能減輕褐化。張紅[8]在對庫拉索蘆薈的組培研究中認為25 ℃培養(yǎng)可以減少褐化。唐德華等[9]研究也表明當溫度上升到30 ℃時，褐化率顯著提高，且褐化時間明顯變快，較適合的溫度為20～25 ℃。

活性炭具有強大的吸附能力，可以吸附褐色有毒物質(zhì)，減少有害物質(zhì)對接種外植體的影響，對遏制褐化的產(chǎn)生有著顯著效果。劉真華等[10]、王立婭等[11]、朱雪征[12]、王 蕾等[13]的研究充分證明了這一點。

經(jīng)常更換新鮮培養(yǎng)基，是防止褐化最直接有效的方法。陳瑤瑤等[14]在研究中采用縮短轉(zhuǎn)接周期，及時轉(zhuǎn)換新鮮培養(yǎng)基的措施，有效抑制了褐化的產(chǎn)生。

有機添加物對褐化也有一定的抑制作用。姚麗娟等[15]研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加10%椰子汁，能促進原球莖的生長，減少原球莖增殖過程中的褐變。唐德華等[9]研究也發(fā)現(xiàn)有機添加物對抑制花梗腋芽和葉片褐化的效果明顯，其中以椰子汁、馬鈴薯泥和香蕉泥的抑制效果最好。

本試驗在對蝴蝶蘭組培的研究中，活性炭能顯著抑制褐化且對褐化的影響最大，轉(zhuǎn)接周期對褐化的影響次之，各因素對褐化影響效應(yīng)大小排序為活性炭>轉(zhuǎn)接周期>溫度>椰子汁；活性炭1.0 g/L、轉(zhuǎn)接周期10 d、溫度25 ℃、椰子汁濃度150 mL/L，為抑制褐化的最優(yōu)處理，這與前人的研究結(jié)果基本一致。

4 參考文獻

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