王立娜，王 穎，朱明珠，桑 曉，毛會(huì)秀，邢佰穎，孫 鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

地衣芽孢桿菌發(fā)酵土鱉蟲(chóng)前后水溶性活性物質(zhì)含量比較及抗凝血活性

王立娜，王 穎，朱明珠，桑 曉，毛會(huì)秀，邢佰穎，孫 鵬*

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

目的：比較未發(fā)酵和經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)、多糖含量的差別，并研究土鱉蟲(chóng)經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后的抗凝血活性；方法：通過(guò)改良Lowry 法、苯酚-硫酸法分別測(cè)定蛋白質(zhì)、多糖含量，以凝血酶原時(shí)間 (PT)、部分活化凝血活酶時(shí)間 (APTT) 、凝血酶時(shí)間 (TT) 為指標(biāo)評(píng)價(jià)抗凝血活性。結(jié)果：水溶性蛋白質(zhì)發(fā)酵前后含量為65.2061 mg/g，55.9015 mg/g，多糖為46.9724 mg/g，84.8736 mg/g；發(fā)酵后能顯著延長(zhǎng)小鼠的 APTT、TT值，但對(duì)PT 值則無(wú)明顯影響。結(jié)論：土鱉蟲(chóng)經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后能顯著提高多糖含量，明顯降低蛋白質(zhì)含量，并且發(fā)酵后具有更強(qiáng)的抗凝效果。

地衣芽孢桿菌；土鱉蟲(chóng)；活性物質(zhì)；抗凝血

土鱉蟲(chóng)又名地鱉、土別蟲(chóng)，是鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉(Eupolyphaga sinesis Walker)或冀地鱉(Eupolyphaga sinesis(Boleny))的雌蟲(chóng)干燥體[1]，性寒味咸，通心肝脾，是傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥[2]。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，屬芽孢桿菌科細(xì)菌，為革蘭氏陽(yáng)性桿菌[3]，能產(chǎn)生多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如纖溶酶。蟲(chóng)類中藥發(fā)酵是生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的最新應(yīng)用，其微生物通過(guò)本身含有或者經(jīng)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的酶及其強(qiáng)大的分解轉(zhuǎn)化能力，不僅可以對(duì)培養(yǎng)基中的纖維、糖類和蛋白加以利用[4]，而且在代謝的過(guò)程中可以對(duì)中藥中的成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化修飾，把一些難以吸收的大分子蛋白質(zhì)、糖類分解成葡萄糖氨基酸，易于吸收[5]。且研究表明，中藥紅花經(jīng)地衣芽孢桿菌C2-13發(fā)酵炮制后，可以明顯使內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)得到抑制，纖溶酶活性顯著提高[6]。受此啟發(fā)，本實(shí)驗(yàn)以地衣芽孢桿菌為發(fā)酵菌，土鱉蟲(chóng)粉為底物，進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，比較其發(fā)酵前后水溶性蛋白質(zhì)、多糖的含量差異，為其發(fā)酵過(guò)程中有效成分的鑒別提供依據(jù)，以及研究土鱉蟲(chóng)經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后抗凝血活性，并與未發(fā)酵土鱉蟲(chóng)粉作為對(duì)比，探究其抗凝活性是否有所提高，為抗凝血活性成分的制備和新藥研發(fā)提供新思路和新方法，豐富蟲(chóng)類中藥發(fā)酵炮制的研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)小鼠，雄性，體質(zhì)量(18-20)g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。

1.2 藥品與試劑

土鱉蟲(chóng)粉(山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)20160821)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民老師鑒定為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉；地衣芽孢桿菌活菌膠囊(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)；復(fù)方丹參片(山東仙河藥業(yè)有限公司)；水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；枸櫞酸鈉；活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測(cè)試盒(武漢中太生物技術(shù)有限公司)；凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)試盒(武漢中太生物技術(shù)有限公司)；凝血酶時(shí)間(TT)測(cè)試盒(武漢中太生物技術(shù)有限公司)；牛血清蛋白(BSA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；福林酚(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、碳酸鈉、酒石酸鉀、無(wú)水硫酸銅、氫氧化鈉皆為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；UV9100B型可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)； KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；半自動(dòng)凝血儀(南京瑞邁科技有限公司)。

2 方法

2.1 地衣芽孢桿菌發(fā)酵土鱉蟲(chóng)粉的制備

精密稱取一定量的土鱉蟲(chóng)干粉，加入活的地衣芽孢桿菌菌粉，并且加少量嗜酸乳酸桿菌來(lái)抑制霉菌的生長(zhǎng)，用一定的量滅菌水將其稀釋成為含2×108個(gè)孢子的混懸液，取適量，拌勻潤(rùn)濕，在35～37℃，濕度為40%，在恒溫恒濕滅菌培養(yǎng)箱中發(fā)酵2天左右，待其表面長(zhǎng)滿白色的菌絲后停止發(fā)酵。

2.2 水溶性活性物質(zhì)制備

稱取未土鱉蟲(chóng)粉、地衣芽孢桿菌發(fā)酵土鱉蟲(chóng)粉各100g加20倍量蒸餾水，超聲提取10 min，抽濾，傾出濾液，重復(fù)上述步驟1次，將2次所得抽濾液混合,3000 r/min，離心，冷凍干燥成粉。

2.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[7]

2.3.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取六支干燥潔凈試管，分別編號(hào)，各自精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ,0.2 ,0.4 ,0.6 ,0.8 ,1 mL，添加蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，搖勻，立即加入5 mL堿性銅溶液，混勻靜置10 min，然后加入0.5 mL福林酚試劑，混勻靜置30 min，在可見(jiàn)光下660 nm處測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=1.7984X+0.0049,R2=0.9983。

2.3.2 樣品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

分別精密稱取10 mg未發(fā)酵土鱉蟲(chóng)和地衣芽孢桿菌發(fā)酵土鱉蟲(chóng)水提液凍干粉，用一定量的蒸餾水溶解，定容到10 mL 容量瓶中，取1 mL 溶液，其余步驟同2.3.1"自立即加入5 mL"起 在660 nm 下測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得濃度，見(jiàn)表1。

2.4 多糖含量的測(cè)定[7]

2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密吸取0 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 ,5.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，編號(hào)。分別吸取2.0 mL 溶液于具塞試管，精密加入5 %的苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，并在40℃下水浴保溫15 min，照紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)490 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=1.8557X-0.0158,R2=0.9986。

2.4.2 樣品多糖含量的測(cè)定

稱取未發(fā)酵土鱉蟲(chóng)和發(fā)酵土鱉蟲(chóng)水提液凍干粉10 mg，加適量的蒸餾水溶解，定容到10 mL 容量瓶中，取2 mL 溶液，其余步驟同2.4.1“自精密加入5%的苯酚溶液1 mL”起 在490 nm 下測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得濃度，見(jiàn)表1。

2.5 蛋白質(zhì)與多糖含量

表1 土鱉蟲(chóng)發(fā)酵前后活性成分的含量對(duì)比

注：土鱉蟲(chóng)發(fā)酵前后水溶性活性成分含量比較**P<0.01，*p<0.5

由表1可知土鱉蟲(chóng)蛋白質(zhì)經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后，明顯減少，這可能是由于蛋白質(zhì)在發(fā)酵的過(guò)程中被轉(zhuǎn)化修飾或者被分解為其他小分子物質(zhì)，如氨基酸。而多糖發(fā)酵后的含量與發(fā)酵前相比則具有極顯著差異，呈現(xiàn)明顯增加的趨勢(shì)，表明了土鱉蟲(chóng)中的某些成分在與地衣芽孢桿菌發(fā)生相互作用后可以促進(jìn)活性物質(zhì)的產(chǎn)生，如多糖。

2.6 PT、APTT、TT 的測(cè)定[8]

取SPF級(jí)小鼠 60 只，分為 6 組，每組各10 只，分別為空白對(duì)照組(蒸餾水)、丹參對(duì)照組、發(fā)酵后高劑量組(900 mg/kg)、發(fā)酵后中劑量組(450 mg/kg)、發(fā)酵后低劑量組(225 mg/kg)，發(fā)酵前高劑量組(900 mg/kg)，各組小鼠連續(xù)給7 d，每日給藥 1 次，給藥體積為 1 ml/100g。于最后一次給藥 1h 后，用 10% 水合氯醛腹腔麻醉，眼球取血，0.109 mol/L 枸椽酸鈉 1:9抗凝，3000 r/min 離心 10 min，取上清液，參照試劑盒操作步驟，應(yīng)用半自動(dòng)血液凝固分析儀依次測(cè)定 PT、APTT 、TT，見(jiàn)表2。

表2 土鱉蟲(chóng)地芽孢桿菌發(fā)酵物抗凝血活性( X±S)

注：**P<0.01，*p<0.5

表2表明，與空白對(duì)照組比較，土鱉蟲(chóng)經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后能顯著延長(zhǎng)小鼠的 APTT、TT值(P<0.01)，但對(duì)PT 值無(wú)顯著性影響，提示地衣芽孢桿菌發(fā)酵物可能是通過(guò)抑制內(nèi)源性系統(tǒng)以及促使血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白而發(fā)揮抗凝作用的。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定APTT、PT 和 TT三個(gè)指標(biāo)檢測(cè)土鱉蟲(chóng)經(jīng)地衣芽孢桿菌發(fā)酵后對(duì)抗凝血作用的強(qiáng)度。發(fā)酵后低劑量組有一定程度的抗凝血效果，但當(dāng)增大給藥濃度，抗凝作用逐漸增強(qiáng)，與空白對(duì)照組比較具有顯著性差異。發(fā)酵后高劑量組與發(fā)酵前高劑量組相比，發(fā)酵炮制后的土鱉蟲(chóng)能明顯提高抗凝作用。PT主要反映外源性凝血系統(tǒng)的作用，但是在本試驗(yàn)中，土鱉蟲(chóng)發(fā)酵后，對(duì)PT并無(wú)顯著的影響，而對(duì)APTT、TT則能顯著延長(zhǎng)其作用時(shí)間，表明了土鱉蟲(chóng)發(fā)酵炮制后并不是通過(guò)阻止外源性凝血系統(tǒng)的途徑來(lái)抑制凝血過(guò)程，從而發(fā)揮抗凝作用，但是真正影響抗凝血的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

[1] 王鳳霞. 中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis)抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué),2013.

[2] 蘇永華. 活血化瘀土鱉蟲(chóng)[N].上海中醫(yī)藥報(bào),2013-09-27(004).

[3] 李福彬. 地衣芽孢桿菌的理化特性及對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能影響機(jī)理的研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[4] 王立娜,馬明珠,王 穎,等. 中藥土鱉蟲(chóng)發(fā)酵前后活性成分的含量對(duì)比[J].湖南中醫(yī)雜志,2016,32(8):200-202.

[5] 劉亞明.發(fā)酵技術(shù)在中醫(yī)藥中的應(yīng)用[M]. 北京: 中國(guó)中醫(yī)出版社,2010:17.

[6] 馮志華. 產(chǎn)纖溶酶地衣芽孢桿菌與中藥紅花相輔相成作用的研究[D].成都：四川大學(xué),2004.

[7] 藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[四部]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 96.

[8] 王 娜,馮艷風(fēng),范會(huì)平,等. 大棗粗多糖體外抗凝血活性的差異化研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,13(12):34-39.

(本文文獻(xiàn)格式：王立娜，王 穎，朱明珠，等.地衣芽孢桿菌發(fā)酵土鱉蟲(chóng)前后水溶性活性物質(zhì)含量比較及抗凝血活性[J].山東化工，2017，46(10)：102-104.)

The Comparison of Active Ingredients for Fermented and UnfermentedEupolyphaga Sinesis Walker by Bacillus Licheniformis and the Anticoagulant Activity

WangLina,WangYing,ZhuMingzhu,SangXiao,MaoHuixiu,XingBaiying,SunPeng*

(1.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)

Objective: To compare the protein and polysaccharide content between unfermented and fermented, and to research the anticoagulant activity of Eupolyphaga sinesis Walke after fermentation of Bacillus licheniformis; Methods: By using the improved Lowry method and sulfuric acid method to deteimine the content of protein and phenol.To investigate the role of anticoagulant activity about the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT) the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT). Results: The Eupolyphaga sinesis Walker before fermentation of water soluble protein content was 65.2061 mg/g, 55.9015 mg/g after fermentation, the polysaccharide content before fermentation was 46.9724 mg/g. After fermentation was 84.8736 mg/g; And The Eupolyphaga sinesis Walker after fermentation of Bacillus licheniformis could significantly prolong the mice of APTT, TT, but had no obvious effect on PT. Conclusion: The Eupolyphaga sinesis Walker after fermentation of Bacillus licheniformis can obviously increase the content of polysaccharide and significantly decrease the content of protein. And it has stronger anticoagulant effect after fermentation.

bacillus licheniformis;eupolyphaga sinesis walker; aactive ingredients; anticoagulant

2017-03-27

2016年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：201610441045);山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2016052)

王立娜，女，研究方向制藥工程;通信作者：孫 鵬，研究方向 ：中藥活性成分與活性評(píng)價(jià)。

R284.1

A

1008-021X(2017)10-0102-03