袁春穎鄧 帥楊大賀李 飛王新齡刁青云

（1遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，興城125100；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂主要病毒病在遼寧的分布與感染差異

袁春穎1鄧 帥2楊大賀2李 飛2王新齡2刁青云2

（1遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，興城125100；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093）

蜜蜂病毒是危害蜂群健康發(fā)展的重要隱性感染因素。自在遼寧省部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)并鑒定黑蜂王臺病毒以來，為深入了解蜜蜂病毒在遼寧省的分布及感染程度的差異，分別在5個地區(qū)采集蜂樣，對8種蜜蜂病毒在遼寧省主要蜜蜂飼養(yǎng)區(qū)的發(fā)生與流行進行調(diào)查，為進一步研究蜜蜂病毒在遼寧省的傳播與流行規(guī)律提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，更為探討病毒的防治提供技術(shù)支持。

蜜蜂病毒；流行與分布；感染差異

1 引言

蜜蜂病毒主要是屬于小核糖核酸病毒家族的一類小RNA病毒[1]。該家族病毒的最主要特點之一是具有較強的隱性感染，無明顯的癥狀表現(xiàn)。自去年在遼寧省發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺病毒（BQCV）以來，不少蜂場均出現(xiàn)大量死亡或爬蜂現(xiàn)象，而最近通過實地蜂樣發(fā)現(xiàn)其病毒病的感染可能性較大。因此，有必要對遼寧省主要地區(qū)的病毒進行調(diào)查。蜜蜂病毒在世界范圍內(nèi)的流行與發(fā)生都有相關(guān)報道，尤其是在西方國家。在對歐洲膜翅目昆蟲RNA病毒的調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)DWV、黑蜂王臺病毒、囊狀幼蟲病毒及以色列急性麻痹病毒是最主要的病原，但是DWV的流行率最高[2]。雖然國內(nèi)外大量學(xué)者已對DWV的基因組特點及組織傾向性進行了深度分析，并且就其傳播途徑及載體也進行了實驗研究。但是，過去幾十年間，DWV一直是主要病毒流行于歐美，如在1999～2004年間，在匈牙利蜂場篩選6個病毒的流行率，發(fā)現(xiàn)DWV達72%的檢測率[3]。同樣，在英格蘭、奧地利、法國、美國均被發(fā)現(xiàn)高于70%的流行率于蜜蜂群中[4]。隨后，瑞典學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DWV與VDV的重組現(xiàn)象非常普遍發(fā)生在感染的蜜蜂中[5]。繼而又發(fā)現(xiàn)DWV基因組在蜜蜂與其寄生性瓦螨間能夠相互傳遞[6]。Ryabov等人對感染DWV的蜜蜂采用高通量測序研究發(fā)現(xiàn)DWV與VDV重組率相當(dāng)高且能夠產(chǎn)生新型蜜蜂病毒[7]。隨后Tomas Erban也證實了感染DWV的蜜蜂能形成多個DWV復(fù)合病毒，且與瓦螨病毒等能夠形成新的毒力更強的病毒[8]。而最近Furst等的研究表明，DWV無論是在實地野外條件還是實驗室也高流行于熊蜂群中，并且闡明了如何在不同地理區(qū)域其感染率從高到低跨越物種傳播與進化的特點[9]。在我國，艾紅霞等調(diào)查了7個蜜蜂病毒在我國部分省份的蜂樣，發(fā)現(xiàn)DWV是最普遍的病毒[10]。楊莆等人對我國境內(nèi)的中華蜜蜂和意大利蜜蜂都進行了7個病毒的流行，發(fā)現(xiàn)DWV在這兩個蜂種間均是最高感染病毒[11]。最近李繼蓮等對我國19個省的中華蜜蜂病毒感染情況進行了普查，發(fā)現(xiàn)黑蜂王臺病毒是最高感染者，但是DWV的感染率僅次于黑蜂王臺病毒[12]。

雖然西方較多國家與地區(qū)均檢測到黑蜂王臺病毒，并且發(fā)現(xiàn)BQCV是所有蜜蜂病毒中流行較為廣泛的病毒之一，但是關(guān)于BQCV在我國部分地區(qū)的發(fā)生與流行的報道相對較少。因此，本研究擬對遼寧省部分商業(yè)化飼養(yǎng)蜂群的主要病毒發(fā)生與流行進行初步調(diào)研，為進一步防治病毒病提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 樣本采集

對遼寧省朝陽市、葫蘆島市、綏中、北票和本溪等5個不同地區(qū)近20個蜂場的健康蜂群（意大利）進行采樣，每群至少采集50～100只蜜蜂，采集的樣品迅速帶回實驗室或冷凍低溫保存。

2.2 病毒RNA提取

將大約10～20只蜜蜂置于50 ml無菌管中，采用組織勻漿設(shè)備進行研磨，至良好細末狀，加入適量的Trizol進行總RNA提取，室溫放置10分鐘后，于12000 rpm下離心15分鐘，取沉淀加入1 ml 75%酒精清洗，詳細步驟按Trizol總RNA提取試劑盒說明操作。將提好的總RNA溶解在20 μl的TE緩沖液或無菌水中并貯存于-20°C冰箱中備用。

2.3 RT-PCR擴增

以提取的總RNA為模板，以Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，先合成第一鏈cDNA，主要以2×Taq Mix（天根，北京）、引物及無菌水，其擴增反應(yīng)體系總體積為20 ul：cDNA模板為1μl，上、下游引物各 1 μl（表1），反應(yīng)緩沖液 10 μl，無菌水 7 μl。反應(yīng)條件為：94℃3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30～33 個循環(huán)，72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 mg/ml溴化乙錠）進行檢測鑒定。

表1 本研究檢測病毒所用引物序列

3 結(jié)果

3.1 各地區(qū)感染率差異

通過對遼寧省5個不同地區(qū)的各類型病毒檢測發(fā)現(xiàn)，IAPV是遼寧省蜜蜂最主要的流行病毒，分布在檢測的4個地區(qū)，并且在葫蘆島地區(qū)其感染率高達80%。而在地區(qū)間病毒的總個數(shù)也非常明顯，葫蘆島市感染了8個病毒的3個病毒，分別為IAPV，DWV和VDV。其中本溪地區(qū)的蜜蜂主要感染CSBV，且感染水平低。

圖1 不同地區(qū)間病毒感染率的差異

3.2 區(qū)域間感染率的比較

為了深入理解病毒感染在區(qū)域間的差異，將朝陽、葫蘆島與北票歸為西部，將綏中歸為中部，本溪歸為東部。從采樣的區(qū)域來看，西部地區(qū)的蜂群感染病毒率明顯高于其它兩個地區(qū)，并且感染病毒的總數(shù)也明顯多于另兩個地區(qū)。

圖2 不同區(qū)域間感染病毒的差異

4 討論

本次對遼寧省主要蜜蜂飼養(yǎng)區(qū)域蜜蜂病毒病的發(fā)生、流行與分布進行了初步的調(diào)查。顯示不同地區(qū)間的病毒感染率與病毒總數(shù)具有明顯的差異，總體是西部與中部地區(qū)的感染率明顯高于東部地區(qū)。該結(jié)果表明不同地理特征區(qū)域可能對病毒的發(fā)生與流行具有明顯的影響，也可能生態(tài)氣候?qū)Σ《镜牧餍谢蚍淙航】涤杏绊?，如東部地區(qū)有較好的生態(tài)與蜜源植物，為蜜蜂的健康發(fā)展提供了基礎(chǔ)食物來源。

本研究初步調(diào)查了蜜蜂病毒在遼寧省部分地區(qū)的分布與流行，為可能影響病毒的發(fā)生或進一步防治蜜蜂病毒提供借鑒。雖然本研究為病毒的發(fā)生提供部分數(shù)據(jù)，但是采樣的范圍及取樣的尺度仍需進一步擴大，以增加結(jié)果的全面性，為進一步分析病毒的流行與發(fā)生規(guī)律提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Distribution and infection difference of honeybee viruses in Liaoning province

Yuan Chunying1,Deng Shuai2,Yang Dahe2,Li Fei2,Wang Xinling2,Diao Qingyun2
(1 The Original Bee Breeding Farm of Liaoning Province,Xingcheng 125100,China;2 Institute of Apicultural Research,CAAS,Beijing 100093,China)

Honeybee viruses are one of the most important factors impacting the colony health.To better understand the distribution and infection difference of honeybee viruses,we collected honeybee samples from 5 regions of Liaoning province and investigated the prevalence of 8 honeybee viruses in Liaoning.Our results will pay a foundation to prevent the honey bee viruses.

honeybee viruses;prevalence and distribution;infection difference

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項經(jīng)費（CARS-45-SYZ3）

袁春穎（1981-），女，高級畜牧師，從事養(yǎng)蜂生產(chǎn)技術(shù)研究及推廣工作，E-mail：chunying0914@163.com

刁青云，女，研究員，從事蜜蜂病害研究工作，E-mail:dqyun1@126.com