方雪穎，歐陽婷，劉 月，袁艷琴

(麗水學(xué)院化學(xué)化工系，浙江 麗水 323000)

二茂鐵基羅丹明B 熒光探針的合成及其對(duì)Hg2+的識(shí)別研究

方雪穎，歐陽婷，劉 月，袁艷琴*

(麗水學(xué)院化學(xué)化工系，浙江 麗水 323000)

以二茂鐵甲酸和氨基硫脲環(huán)化反應(yīng)得到2-氨基-5-二茂鐵基-1,3,4-噻二唑，再與羅丹明B酰氯胺化得到二茂鐵基羅丹明B衍生物R，采用1H NMR、13C NMR及ESI-MS對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，化合物R作為熒光探針能選擇性地識(shí)別Hg2+，且受常見金屬離子的干擾較小。探針R 的熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度(5×10-7～2.5×10-6mol/L)呈良好的線性關(guān)系，并在Hela活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了Hg2+的成像。

二茂鐵；熒光探針；羅丹明B；汞離子；細(xì)胞成像

隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，環(huán)境污染問題也隨之日趨嚴(yán)重，尤其是重金屬污染，使人們的生存環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)急劇增大。汞是最常見的重金屬污染源之一，而且環(huán)境中的汞鹽可以被微生物轉(zhuǎn)化為甲基汞，并進(jìn)一步通過食物鏈被人體吸收，從而對(duì)人類健康造成損害[1-3]。因此, 發(fā)展選擇性高、靈敏度好的檢測(cè)和識(shí)別Hg2+的方法具有重要的意義。近幾年，熒光分析法由于其具有檢測(cè)靈敏度高(可實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè))、選擇性好、成本低、易操作、適用面廣，并可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)金屬離子實(shí)現(xiàn)原位和成像分析等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各種金屬離子的檢測(cè)，成為環(huán)境分析和生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[4-7]。由于自旋軌道耦合效應(yīng)，Hg2+對(duì)熒光團(tuán)具有猝滅作用，而羅丹明衍生物具有大摩爾消光系數(shù)，高突光量子產(chǎn)率和位于可見光區(qū)域的長(zhǎng)吸收和發(fā)射波長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種公認(rèn)的理想熒光增強(qiáng)型熒光分子探針。目前基于羅丹明結(jié)構(gòu)的高選擇，高靈敏的Hg2+的探針已有較多報(bào)道[8-12]。但其中許多仍然存在一些不足，例如靈敏度低、易受其它金屬離子的干擾(尤其是Cu2+, Ni2+, Cr3+和Fe3+)，并且較大一部分的探針只能在有機(jī)溶劑例如乙腈溶液中起作用，這使得它們很難在體外和活體實(shí)驗(yàn)中被使用。因此，本論文設(shè)計(jì)合成了一種基于二茂鐵基的羅丹明B 類Hg2+熒光探針X(圖1)。研究表明，化合物R不僅對(duì)Hg2+具有高的選擇識(shí)別能力，且受常見金屬離子的干擾較??；而且，這種增強(qiáng)型熒光探針具有很好的膜透性，我們成功的把它應(yīng)用于在熒光顯微鏡下Hela細(xì)胞中Hg2+的水平的檢測(cè)。探針化合物R 的合成路線如圖1 所示。

圖1 R 的合成

1 結(jié)果與討論

1.1 分子的設(shè)計(jì)與合成

羅丹明氧雜蒽類熒光探針的螺酰胺環(huán)獨(dú)特的開閉環(huán)結(jié)構(gòu)是理想的“OFF-ON”熒光開關(guān)模型，是設(shè)計(jì)熒光增強(qiáng)型探針的理想結(jié)構(gòu)。另外，噻二唑基團(tuán)可以提高探針分子與過渡金屬離子的鍵合能力，增強(qiáng)探針選擇性，并使使螺環(huán)打開產(chǎn)生熒光。因此，本文在羅丹明B 結(jié)構(gòu)中引入二茂鐵噻二唑基團(tuán)，設(shè)計(jì)了目標(biāo)化合物R。R 的合成路線如Scheme 1 所示，首先合成2-氨基-5-二茂鐵基-1,3,4-噻二唑，然后與羅丹明B酰氯反應(yīng)得到新型羅丹明B 衍生物R。該反應(yīng)條件溫和、后以為原料，處理簡(jiǎn)便、產(chǎn)物收率高。

1.2 化合物R 對(duì)金屬離子的選擇性識(shí)別

為了測(cè)定化合物R 對(duì)金屬離子的識(shí)別性能，在10mmol/L HEPES/EtOH (V/V=4/6, pH值=7.0)溶液中，通過熒光光譜檢測(cè)化合物R 對(duì)金屬離子(Hg2+、Fe3+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ni2+、Cr3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Cd2+和Cu2+)的選擇性識(shí)別，結(jié)果如圖2和3 所示。從圖2和3 可以看出，在未加入金屬離子或者加入Fe3+、Co2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ni2+、Cr3+、Mn2+、Ca2+、Li+、Cd2+、Cu2+時(shí)，溶液顯示無色，幾乎沒有熒光發(fā)射，說明R主要以螺環(huán)的形式存在；而加入Hg2+后，在最大發(fā)射波長(zhǎng)582 nm 處熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)，溶液的顏色由無色變成粉紅色，這可能是由于Hg2+誘導(dǎo)電子發(fā)生轉(zhuǎn)移導(dǎo)致螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)。由此可見，裸眼即可定性的檢測(cè)溶液中是否含有Hg2+。

圖2 (a)探針R 對(duì)金屬離子的顏色變化及(b)探針R 對(duì)金屬離子的熒光變化

Fig.2 The colorimetric (a) and fluorometric (b) changes of R (10 μmol/L) upon addition of Hg2+(50 μmol/L) and other cations(50 μmol/L) in 10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V=4/6, pH值=7.0) solution (note: The two photos were obtained in normal light (a) and upon at 365 nm using UV lamp (b), respectively)

圖3 R (10 μmol/L)對(duì)金屬離子(20 μmol/L)的選擇性

Fig.3 Fluorescence spectra of probe R (10 μmol/L) to different metal ions (20 μmol/L)

進(jìn)一步考察了其它金屬離子和Hg2+共存時(shí)對(duì)Hg2+測(cè)定的影響。所有離子的濃度均為20 μmol/L, 黑色柱狀圖代表在Hg2+存在時(shí)加入不同的金屬離子。從圖4中可以看出，共存離子存在下，探針R 對(duì)Hg2+識(shí)別的熒光強(qiáng)度基本保持不變，說明探針R 對(duì)Hg2+識(shí)別具有較強(qiáng)的抗干擾能力。因此，化合物R 是一個(gè)高選擇性的熒光增強(qiáng)型Hg2+探針。

圖4 其他金屬離子和Hg2+ (20 μmol/L)

Fig.4 Fluorescence intensity changes of R (10 μmol/L) upon the addition of different metal ions (20 μmol/L) in and without the presence of Hg2+(20 μmol/L) of different ions reacting to probe R. From left to right 20 μmol/L of (1) Fe3+, (2) Co2+,(3) Mg2+,(4) Zn2+,(5) Al3+, (6) Na+, (7) Ni2+, (8) Cr2+,(8) Mn2+,(10) Ca2+,(11) Li+,(12) Cd2+,(13) Cu2+,(14) Hg2+(black bars: R with different ions, red bars: R with Hg2+and other metal ions)

1.3 不同濃度Hg2+對(duì)化合物R 熒光光譜的影響

在10 mmol/L HEPES/EtOH (V/V=4/6, pH值=7.0)溶液中測(cè)定了在不同Hg2+濃度下化合物R 的熒光發(fā)射光譜，如圖5 所示。在化合物R 的最大發(fā)射波長(zhǎng)(582 nm)處，隨著Hg2+濃度的不斷增大，溶液的熒光強(qiáng)度也不斷的增加，這表明化合物R 和Hg2+有良好的結(jié)合作用。

進(jìn)一步的研究結(jié)果(如圖6 所示)表明，Hg2+濃度在5.1×10-7～2.5×10-6mol/L 范圍內(nèi)與探針R 的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，曲線方程為y=-17.9+69.7x，相關(guān)系數(shù)R2=0.99118，表明化合物R 可以定量地檢測(cè)此范圍內(nèi)的Hg2+含量。

圖5 R (10 μmol/L)中逐漸加入Hg2+(0～5.5 equiv.)的熒光發(fā)射變化曲線圖

圖6 R 的熒光強(qiáng)度隨Hg2+濃度(0.5×10-7～2.5×10-7 mol/L)變化的線性關(guān)系圖

1.4 絡(luò)合機(jī)理解釋

處于500～650nm處的紫外吸收峰是一個(gè)羅丹明螺環(huán)打開的明顯特征。L-Hg2+在582nm處產(chǎn)生了紫外吸收如圖3及圖5所示，我們認(rèn)為當(dāng)探針L的溶液中加入Hg2+后產(chǎn)生的熒光增強(qiáng)，是由于Hg2+羅丹明B絡(luò)合后使螺環(huán)打開產(chǎn)生了熒光，這與一般的基于羅丹明結(jié)構(gòu)的Hg2+熒光探針沒有差別(圖7)。

圖7 R 識(shí)別Hg2+的可能機(jī)理

1.5 化合物R 對(duì)細(xì)胞中Hg2+的熒光成像實(shí)驗(yàn)

在細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，將10 μmol/L 探針R 溶液加入到育有Hela細(xì)胞的培養(yǎng)液中孵化，在37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，用PBS 緩沖溶液洗去細(xì)胞外的殘余探針R，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞沒有熒光信號(hào)產(chǎn)生(圖8a)。當(dāng)在Hela細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中加入10μm的Hg2+孵化0.5h，然后再加入探針L 孵化2h后，在相同的測(cè)試條件下，再次成像發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞發(fā)出了紅光的熒光(圖8b)，這表明探針R 具有良好的細(xì)胞滲透性，可以對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的Hg2+進(jìn)行熒光成像。當(dāng)孵化時(shí)Hg2+濃度的增加至20μm，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，這樣結(jié)果表明L對(duì)汞離子的檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)的劑量依賴性(圖8c)。

(a) Fluorescence images of Hela cells treated with R (10 μmol/L);(b) Fluorescence images of Hela cells incubated with R (20 μmol/L), then further incubated with Hg2+(10 μmol/L) for 2 h;(c) Fluorescence images of Hela cells incubated with R (20 μmol/L) , and further incubated with Hg2+(20 μmol/L) for 2 h

圖8 R 在Hela細(xì)胞中對(duì)Hg2+的熒光成像

Fig.8 Fluorescence images of Hg2+in Hela cells with R

2 結(jié)論

本文以羅丹明B 為熒光基團(tuán)，二茂鐵基噻二唑片段為識(shí)別基團(tuán)設(shè)計(jì)合成了一種新型的Hg2+熒光探針化合物R，并對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。在10 mmol/L HEPES/EtOH(V/V=4/6, pH值=7.0)溶液中，探針R 可以選擇性識(shí)別Hg2+。在Hg2+濃度(5.1×10-7～2.5×10-6mol/L)范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度和Hg2+濃度具有良好的線性關(guān)系，可在此范圍內(nèi)定量地檢測(cè)Hg2+的含量。另外，R在Hela活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了Hg2+的熒光成像,對(duì)生物體活細(xì)胞內(nèi)Hg2+檢測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 儀器與試劑

Brucker AVANCE II 300 MHz 核磁共振儀(DMSO為洛劑，TMS為內(nèi)標(biāo)；X-4型數(shù)字顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，Thermo LXQ 液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司)，CaryEclipse 熒光分光光度計(jì)(澳大利亞瓦里安有限公司)。

所有試劑均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)所用的水均為去離子水。

3.2 5-二茂鐵基噻二唑羅丹明B的合成

3.2.1 2-氨基-5-二茂鐵基-1,3,4-噻二唑的合成

將二茂鐵甲酸(60mmol)和氨基硫脲( 78mmol)加入盛有80mL POCl3的250mL圓底燒瓶中，攪拌并加熱到60℃保持2h，然后加熱到回流反應(yīng)4h后停止反應(yīng)。冷卻至室溫。將溶液慢慢倒入盛有冰的燒杯中，攪拌至有泡沫產(chǎn)生，然后在0℃冰水浴中，用稀的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值 8～9。析出固體抽濾，粗產(chǎn)品用柱層析法提純(展開劑為乙酸乙酷)，然后用乙醇重結(jié)晶，得到橙黃色固體，產(chǎn)率16.5%。m.p. 186～187℃；1H MNR (300 MHz, DMSO-d6): δ 7.16 (s, 2H; N-H), 4.72 (t, J=1.8Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.41 (t, J=1.8 Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.15(s, 5H; Ferrocene-H). HRMS (EI): m/z(%):calcd for [M+H]+C12H12FeN3S+: 286.0101 found: 286.0094。

3.2.2 2熒光探針L的合成

將羅丹明B鹽酸鹽(0.479g g，1 mmol ) 1,2-二氯乙烷( 15mL)和POCl3( 5mL )加入100mL圓底燒瓶中加熱回流4h，然后將反應(yīng)完的混合體系減壓蒸餾，得到的羅丹明酰氯。將其溶解于干燥的二氯甲烷(15mL)中，再向其中加入三乙胺(3mL)作為縛酸劑，將2-氨基-5-二茂鐵-1,3,4-噻二唑( 0.342g，1.2mmol)加入其中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下常溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h。粗產(chǎn)品通過柱層析法提純(展開劑為石油醚/乙酸乙酯= 3:1, V/V )，再通過乙醇重結(jié)品后得到最終產(chǎn)品為橙黃色固體，產(chǎn)率17.6%(m.p.262～264℃)；1H MNR (300 MHz, DMSO-d6): δ 8.05 (d, J=7.2Hz, 1H; Ar-H), 7.74-7.63 (m, 2H; Ar-H), 7.17 (d, J=7.5 Hz, 1H; Ar-H), 6.38 (t, J=3.45Hz, 2H; Ar-H), 6.34 (s, 2H, Ar-H), 6.26-6.22 (m, 2H; Ar-H), 4.80 (t, J=1.8 Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.48 (t, J=1.8 Hz, 2H; Ferrocene-H), 4.11 (s, 4H; Ferrocene-H), 3.34-3.26 (m, 8H; CH2), 1.07 (t, J=6.9 Hz, 12H; CH3);13C NMR (75 MHz,DMSO-d6 ppm): δ 166.6, 163.9, 154.5, 164.0, 149.4, 136.2, 130.2, 128.5, 128.0, 125.5, 124.4, 108.5, 106.0, 98.1, 75.1, 71.1, 70.8, 69.2, 68.5, 44.5, 13.4; IR (KBr): 3084.8, 2971.1，2892.5, 2867.0, 1699.6, 1613.5, 1515.6, 1480.8, 871.8, 823.4, 710.3 cm-1; MS (EI): m/z(%): calcd for [M+H]+C40H40FeN5O2S+: 710.2252, found: 710.2272。

3.3 熒光光譜的測(cè)定方法

將探針R用乙醇配成 1×10-3mol/L 的溶液，金屬鹽用去離子水配成1×10-3mol/L 的溶液。移取探針R溶液0.1 mL 置于10 mL 容量瓶中，移取金屬鹽溶液0.2mL 加入容量瓶中，再用10 mmol/L HEPES/EtOH(V/V=4/6, pH值=7.0)緩沖溶液定容，震蕩使其混合均勻，得到測(cè)試溶液中探針濃度為10 μmol/L，金屬鹽溶液濃度為20 μmol/L。進(jìn)而測(cè)定其熒光發(fā)射光譜(選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性、濃度梯度、Job 曲線等)及pH對(duì)探針分子熒光發(fā)射光譜的影響，pH值由1 mol/L HCl 和NaOH 調(diào)節(jié)。測(cè)試條件：在室溫下，將待測(cè)溶液裝入1 cm × 1cm × 4 cm 的石英比色皿中，激發(fā)波長(zhǎng)(λ)為530 nm，掃描540～750 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜。

3.4 細(xì)胞培養(yǎng)和成像

Hela細(xì)胞在含有10%的牛血清、潮濕空氣(含有5%CO2)的是在DMEM培養(yǎng)基( Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco )中進(jìn)行培養(yǎng)。熒光成像過程是將5×104mL-1的細(xì)胞接種到24個(gè)孔板中；檢測(cè)Hg2+的實(shí)驗(yàn)是在相同的培養(yǎng)基中加入10 μm或者20 μm的HgCl2，放置孵化細(xì)胞1h。細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)前先用PBS洗兩遍，然后再加入10 μm的探針L放置在培養(yǎng)器中1.5 h。用PBS洗滌兩次后，細(xì)胞在相差顯微鏡下進(jìn)行熒光成像。

[1] Mercer J F. The molecular basis of copper-transport diseases[J]. Trends Mol Med, 200l, 7(2): 64-69.

[2] Harrison M D, Dameron C T. Molecular mechanisms of copper metabolism and the role of the Menkes disease protein [J]. J Biochem Mol Toxicol, 1999, 13(2): 93-106.

[3] Strausak D, Mer∞r(nóng) J F B, Dieter H H, et al. Copper in disorders with neurological symptoms: Alzheimer's, Menkes, and Wilson diseases[J].Brain Res Bull, 200l, 55(2): 175-185.

[4] Zhang J F,Zhou Y, Yoon J, et al. Recent progress in fluorescent and colorimetric chemosensors for detection of precious metal ions (silver, gold and platinum ions) [J]. Chem Soc Rev, 2011, 40:3416-3429.

[5] Feng Y,Cheng J, Zhou L, et al. Ratiometric optical oxygen sensing: a review in respect of material design[J]. Analyst 2012, 137:4885-4901.

[6] Chen X, Tian X, Shin I, et al. Fluorescent and luminescent probes for detection of reactive oxygen and nitrogen species[J]. Chem Soc Rev, 2011 , 40(9): 4783-4804.

[7] Zhou Y, Yoon J. Recent progress in fluorescent and colorimetric chemosensors for detection of amino acids[J]. Chem Soc Rev,2012, 41：52-67.

[8] Kim H N， Lee M H， Kim H J， et al. A new trend in rhodamine-based chemosensors: application of spirolactam ring-opening to sensing ions[J]. Chem Soc Rev,2008, 37: 1465-1472.

[9] Dujols V, Ford F, Czarnik A W. A long-wavelength fluorescent chemodosimeter selective for Cu(II) ion in water[J]. J Am Chem Soc,1997, 119: 7386-7387.

[10] 李 娜, 劉美玲, 尹文婷, 等.羅丹明基“OFF-ON”型熒光探針研究的一些新進(jìn)展[J]. 有機(jī)化學(xué), 2011, 31(1):39-53.

[11] 孫 偉, 胡德禹, 吳志兵, 等.基于羅丹明的重金屬和過渡金屬陽離子熒光分子探針研究進(jìn)展[J].有機(jī)化學(xué), 2011, 31(7)：997-1010.

[12] Mariana B， Carlos A M A， José M G M. Synthesis and applications of Rhodamine derivatives as fluorescent probes[J].Chem Soc Rev，2009, 38(8):2410-2433.

(本文文獻(xiàn)格式：方雪穎，歐陽婷，劉 月，等.二茂鐵基羅丹明B 熒光探針的合成及其對(duì)Hg2+的識(shí)別研究[J].山東化工，2017，46(08)：36-39.)

A Novel Rhodamine B Fluorescent Probe for Hg2+: Synthesis and Evaluation

FangXueying,OuYangting,LiuYue,YuanYanqin*

(Department of Chemistry, Lishui University, Lishui 323000)

A novel rhodamine B fluorescent probe R was synthesized by the amination of rhodamine B with 5-ferrocenyl-1,3,4-thiadiazol-2-amine which obtained by cyclization of ferrocenecarboxylic acid and thiourea, and its structure was characterized by1H NMR,13C NMR, and ESI-MS. It exhibited very strong fluorescence responses to Hg2+with remarkably high selectivity for Hg2+over other metal ions. When the concentration of Hg2+was in the range of 5×10-7～2×10-6mol/L, there was a good linearity between the fluorescence intensity and the concentration of Hg2+. The fluorescence imaging experiments of Hg2+in Hela living cells revealed its potential application in biological system.

ferrocene; fluorescent probe; rhodamine B; mercury ion; cell imaging

2017-02-21

浙江省麗水市公益性技術(shù)應(yīng)用項(xiàng)目(2014JYZB49)，2016年浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目

方雪穎(1998—), 女, 浙江杭州人, 本科；通信作者: 袁艷琴( 1977—), 女, 江西樟樹人, 主要從事有機(jī)合成方法學(xué)的研究。

O657.3

A

1008-021X(2017)08-0036-04