陶貴斌，何慧楠，李雪惠，劉雪瑩，齊濱，劉莉

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130117）

馬齒莧多糖體外免疫調(diào)節(jié)活性研究

陶貴斌，何慧楠，李雪惠，劉雪瑩，齊濱*，劉莉*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130117）

以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型研究馬齒莧多糖對細(xì)胞吞噬能力的影響，刺激產(chǎn)生NO含量，釋放IL-6、TNF-α來考察其對巨噬細(xì)胞免疫活性的影響。結(jié)果表明馬齒莧多糖可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，釋放免疫因子等方面增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫活性。

馬齒莧多糖；巨噬細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)

馬齒莧（Portulace oleracea L.）為馬齒覓科一年生肉質(zhì)草本植物，是一種藥食兩用植物，主要以野生為主，西歐發(fā)達(dá)國家己經(jīng)將其發(fā)展栽培成為蔬菜以供食用。馬齒莧在我國資源儲備極其豐富，其所包含的化學(xué)成分多種多樣，主要有氨基酸、多糖類、有機(jī)酸、黃酮類、香豆素、生物堿、強(qiáng)心苷、蒽醌、維生素和礦物質(zhì)等化合物[1-5]。馬齒莧具有廣泛的藥理作用，在抗衰老、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化，以及保肝護(hù)肝等方面具有重要的作用[6-9]。馬齒莧多糖是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種新的活性成分，具有提高免疫力，延緩衰老，抗腫瘤等活性[10-11]，國內(nèi)外學(xué)者對馬齒莧多糖的藥理活性的研究多集中于動物實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平去探索馬齒莧多糖的生物活性報道較少，本研究以馬齒莧多糖提取物為研究對象，探討馬齒莧多糖對小鼠巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞水平研究其體外免疫調(diào)節(jié)的作用，為馬齒莧多糖的活性研究提供新的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

馬齒莧：采于吉林省長春市市郊。

小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株RAW264.7（ATCCTIB-71）：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

DMEM 培養(yǎng)基：Gibco公司；噻唑藍(lán)（MTT）：Thiazoly公司；二甲基亞砜（DMSO）：天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；TNF-α酶聯(lián)免疫測定試劑盒、IL-6酶聯(lián)免疫測定試劑盒：上海朗頓生物科技有限公司；脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：Sigma 公司；Griess：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

Infinite 200 Pro型酶聯(lián)免疫檢測儀：瑞士TECAN公司；3111型CO2培養(yǎng)箱：Thermo Forma公司。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧多糖的制備

準(zhǔn)確稱量干燥的馬齒莧100 g，粉碎，將粉末置于圓底燒瓶中加入95%乙醇，攪拌、80℃水浴，冷凝回流6 h，除去乙醇，干燥。干燥后粉末水煎煮3次，離心取上清液，4℃靜置過夜，取上清溶液真空濃縮，濃縮液加無水乙醇沉淀過夜，Sevage法除蛋白，干燥，制得馬齒莧多糖（POP）樣品。采用苯酚硫酸法測得多糖含量為23.35%，精密稱取多糖干粉20 mg，加10 mL無菌PBS緩沖液溶解，用0.22 μm濾膜無菌過濾分裝，-20℃保存，備用。待做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時，取出用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液稀釋成 200、100、50 μg/mL。

1.2.2 細(xì)胞吞噬能力實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為6×105個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度藥物每孔20 μL，補(bǔ)加80 μL培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，空白組以同體積無菌PBS代替，陽性對照組加入同體積20 μg/mL LPS，培養(yǎng)24 h。用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞吞噬能力，每孔加入100 μL 0.075%的中性紅溶液，繼續(xù)孵育1h后，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）吸去殘留中性紅，加入150 μL90%乙酸乙醇裂解液，充分混勻，測定每孔在550 nm處的光度值（OD）。

1.2.3 NO含量檢測

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為2×106個/mL接種于96孔板，每孔100 μL，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度藥物每孔20 μL，補(bǔ)加80 μL培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，空白組以同體積無菌PBS代替，陽性對照組加入同體積20 μg/mL LPS，培養(yǎng)24 h。采用Griess法測定NO含量：標(biāo)準(zhǔn)孔加入濃度為100 μmol/L 的亞硝酸 0、10、20、30、40、50 μL，加蒸餾水補(bǔ)足50 μL，樣品孔分別加入各組培養(yǎng)基50 μL，之后再加入50 μL Griess試劑，振搖10 min，測定各孔于540 nm處的光度值（OD），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔繪制出亞硝酸濃度與光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算各樣品孔NO濃度。

1.2.4 IL-6、TNF-α 含量檢測

細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6的測定參照小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，將各組細(xì)胞上清液在10 000 r/min、4℃下離心10 min，吸取上清20 μL進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，在450 nm測定吸光度值（OD值），計算IL-6含量。

細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α的測定參照小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說明，將各組細(xì)胞上清液在10 000 r/min、4℃下離心10 min，吸取上清20 μL進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，在450 nm測定吸光度值（OD值），計算TNF-α含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包完成，以P＜0.05表示差異顯著；P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬齒莧多糖對細(xì)胞吞噬能力的影響

細(xì)胞具備吞噬能力的高低被當(dāng)做衡量細(xì)胞活性的一個關(guān)鍵指標(biāo)。本研究采取中性紅法來評價馬齒莧多糖對RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響（，n=9）Fig.1 Effect of purslane polysaccharides on the phagocytic ability of RAW264.7（，n=9）

如圖1所示，從馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響可以看出，細(xì)胞吞噬能力與樣品濃度呈量效關(guān)系。結(jié)果表明馬齒莧多糖具有增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力的作用（P＜0.01）。

2.2 馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

NO是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的主要介質(zhì)，氧化應(yīng)激能參與并加劇炎癥反應(yīng)，因此，NO的水平與多種炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。本研究采用Griess法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液的亞硝酸鹽含量，從而間接反應(yīng)RAW264.7細(xì)胞的NO分泌水平。Griess法測定NO含量所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 3x+0.040 9，R2=0.999 7，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得各組NO濃度如圖2所示。

圖2 馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響（，n=9）Fig.2 Effect of purslane polysaccharides on NO production of RAW264.7（，n=9）

由圖2可知空白組細(xì)胞產(chǎn)生NO最少，為（6.64±0.61）μmol/L，陽性對照組細(xì)胞產(chǎn)生NO最多，為（26.68±0.88）μmol/L，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞產(chǎn)生NO含量隨馬齒莧多糖濃度的增加而增加。馬齒莧多糖不同濃度與空白組相比均有顯著性（P＜0.01），且各實(shí)驗(yàn)組NO濃度均低于陽性對照組。

2.3 馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α的影響

LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。被激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞可以釋放出多種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中具有重要作用。馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6的影響如圖3所示。

圖3 馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6和TNF-α的影響（±s，n=9）Fig.3 Effect of purslane polysaccharides on IL-6 and TNF-α production of RAW264.7（，n=9）

從圖3可以看出，各組IL-6濃度均高于空白組。馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6有促進(jìn)作用，和空白組對比具有顯著性意義（P＜0.01）。

TNF-α可以殺死腫瘤細(xì)胞或起到抑制其生長的功效，可以提高中性粒細(xì)胞的吞噬、增殖和分化能力。馬齒莧多糖各濃度均能促進(jìn)分泌TNF-α（P＜0.01），濃度為 200 μg/mL 時，TNF-α 含量最高為（3.53±0.11）ng/mL，是空白組的9.8倍。各組TNF-α濃度均小于陽性對照組，說明馬齒莧多糖促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的作用溫和。

3 結(jié)論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，病原微生物入侵機(jī)體時首先被巨噬細(xì)胞識別、吞噬，巨噬細(xì)胞的吞噬能力影響免疫應(yīng)答強(qiáng)弱。本研究中用不同濃度的馬齒莧多糖培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞，研究細(xì)胞吞噬能力、NO分泌能力、IL-6和TNF-α釋放能力。吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬齒莧多糖能夠激活RAW264.7細(xì)胞并具有增強(qiáng)其吞噬作用的能力。NO在細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)中扮演著信使及效應(yīng)分子的角色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬齒莧多糖可以提高RAW264.7細(xì)胞的NO分泌水平，且與LPS模型對照組比較中同時具有差異顯著性，證明其對NO釋放水平的提高是在一定安全范圍之內(nèi)，并沒有達(dá)到導(dǎo)致產(chǎn)生炎癥的效果。

巨噬細(xì)胞除對病原微生物的吞噬消滅作用外，還有免疫遞呈的作用。巨噬細(xì)胞免疫遞呈作用是通過釋放IL-6、TNF-α等免疫因子來實(shí)現(xiàn)的，這些免疫因子刺激T/B細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)免疫級聯(lián)反應(yīng)。TNF-α是一個經(jīng)典的炎癥指標(biāo)，具有誘導(dǎo)多種炎癥因子產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的作用，處于炎癥級聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，其表達(dá)量的多少可以直接反映炎癥的嚴(yán)重程度。IL-6作為一種多功能細(xì)胞因子，具有抗炎和致炎的雙向功能，其作用與組織中的含量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：馬齒莧多糖對RAW264.7細(xì)胞釋放這兩種細(xì)胞因子具有較顯著的增強(qiáng)作用。

由上述結(jié)果可知，馬齒莧多糖可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、殺死病原微生物的能力和釋放免疫因子三方面增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明馬齒莧多糖具有較好的活化巨噬細(xì)胞的活性，可以作為增強(qiáng)免疫的保健品和食品的原材料。

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The Study of Immunoregulatory Activity in vitro of Purslane Polysaccharides

TAO Gui-bin，HE Hui-nan，LI Xue-hui，LIU Xue-ying，QI Bin*，LIU Li*
（College of Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

The effects of purslane polysaccharides on phagocytosis of macrophages RAW264.7 were determined to stimulate the production of NO content，to release of IL-6，TNF-α to investigate the immune activity of macrophages.The results show that purslane polysaccharides can enhance macrophage phagocytosis，release of immune factors to enhance the macrophage immune activity.

purslane polysaccharides；macrophage；immunoregulation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.039

2016-12-14

國家自然科學(xué)基金（81274038）；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目（JJKH20170725KJ）

陶貴斌（1980—），男（漢），碩士，從事中藥分析研究。

*通信作者：劉莉（1978—）女，博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥活性研究；齊濱（1978—）男，博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥活性研究。