裴云逸，陸星星，武翠芳，徐艷飛

（云南省玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，云南玉溪653106）

花生衣中原花青素及多酚物質(zhì)含量分析研究

裴云逸，陸星星，武翠芳，徐艷飛

（云南省玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，云南玉溪653106）

研究用香草醛-鹽酸法測定花生衣中原花青素含量以及用紫外法測定多酚物質(zhì)含量的方法。對香草醛-鹽酸法測定花生衣中原花青素含量的方法進行因素研究，在25℃以下溫度的“6 mL5%香草醛-乙醇溶液+3 mL濃鹽酸”體系中加入0.5 mL反應(yīng)液，以499 nm為測定波長，以吸光值相對穩(wěn)定時間為顯色時間，測得白、紅兩種花生衣中原花青素含量差異不大，同時以紫外法測得兩種花生衣多酚物質(zhì)含量也差異不大。試驗比較了幾種花生衣中原花青素含量與多酚物質(zhì)含量，結(jié)果表明花生衣中多酚物質(zhì)主要成分是原花青素類物質(zhì)。

花生衣；原花青素；多酚物質(zhì)

花生除了用于壓榨花生油外，還是我們飯桌上經(jīng)常直接食用的食品。人們經(jīng)常直接生吃，或者煮吃、炒吃、油炸吃等?；ㄉ瑫r也是營養(yǎng)保健食品，在我國被稱為“十大長壽食品”之一，花生仁的蛋白質(zhì)和脂肪含量極高。人們對于花生的喜愛還因為花生衣色素中含有多種具有生物活性的多酚類物質(zhì)，尤其是抗氧化性極強的原花青素與白藜蘆醇。

目前對花生衣色素的研究大多數(shù)集中在色素的提取技術(shù)和抗氧化性研究方面，而不同顏色花生衣中多酚物質(zhì)含量以及原花青素含量分析方面的研究較少。對原花青素的研究大多數(shù)集中在葡萄籽原花青素方面。根據(jù)已報道研究[1-2]，花生衣原花青素中包含有大量具有生物活性價值的低聚體。

植物中原花青素總含量的測定常用香草醛法、正丁醇－鹽酸法、鐵鹽催化比色法等。其中香草醛法的原理基于酚醛縮合反應(yīng)[3-4]，在酸的催化作用下，含間苯二酚或間苯三酚的化合物與芳香醛類物質(zhì)發(fā)生縮合反應(yīng)而生成有色正碳離子，兒茶素、表兒茶素類單體及其聚合體PC（原花青素）含有間苯三酚結(jié)構(gòu)，在酸的催化作用下可與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)，生成產(chǎn)物顏色與濃度在一定范圍成正比關(guān)系。已報道對香草醛-鹽酸法測定原花青素含量的研究中，香草醛濃度與鹽酸用量多不一致，顯色反應(yīng)時間也有較大差異。本文借鑒已報道香草醛-鹽酸法測定原花青素的研究[5-7]，通過試驗研究確立了香草醛-鹽酸法測定花生衣中原花青素含量的方法。采用紫外法分析了花生衣中包括原花青素類物質(zhì)以及其他酚類物質(zhì)的總多酚物質(zhì)的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白、紅花生：本地超市或農(nóng)貿(mào)市場購買；原花青素對照品（UV≥95%）：上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇：天津風船化學試劑；香草醛：國藥集團化學試劑有限公司；濃鹽酸：廣東西隴化工；超純水：玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院實驗室自制。

1.2 儀器設(shè)備

JL-180DT超聲波清洗器：上海吉理超聲儀器有限公司；UV2550紫外可見分光光度計：島津儀器（蘇州有限公司）；BT124S電子天平、BT2202S電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；CX-301家用多功能料理機：中山市九陽小家電有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生衣原花青素及多酚物質(zhì)的提取

稱取花生衣粉2.000 g于100 mL容量瓶中，按照已研究方法[8]用80 mL60%的乙醇溶液在55℃下超聲波提取20 min，冷卻后定容至100 mL，用中速定量濾紙過濾，所得樣液用于原花青素及多酚物質(zhì)含量分析，其中用于多酚物質(zhì)含量分析時樣液需稀釋。

1.3.2 香草醛-鹽酸法測定花生衣原花青素

1.3.2.1 顯色反應(yīng)最大吸收波長的確定

以60%乙醇配制0.05 mg/mL～1.00 mg/mL的原花青素的對照品溶液，選取其中一濃度的對照品溶液，參考已報道文獻[9-10]，采用“6 mL4%香草醛-乙醇溶液+1 mL濃鹽酸+0.50 mL對照品溶液”的方式反應(yīng)5 min以上，同時以“6 mL4%香草醛-乙醇溶液+1 mL濃鹽酸+0.50 mL60%乙醇”體系為對照，用UV2550進行光譜掃描。對花生衣提取液同法試驗，確定最大吸收波長。

1.3.2.2 顯色反應(yīng)溫度控制，反應(yīng)時間、濃鹽酸用量及香草醛濃度選擇

根據(jù)報道[11]當反應(yīng)溫度較高時吸光值隨溫度以及時間變化均有較大幅度降低，但當溫度低于25℃時，反應(yīng)產(chǎn)物吸光值隨著時間變化比較穩(wěn)定，因此反應(yīng)溫度應(yīng)控制在25℃以下。試驗中由于濃鹽酸在加入過程中放熱，因此先配制“香草醛-鹽酸”體系，待冷卻后再進行顯色反應(yīng)。本文將“香草醛-鹽酸”體系放入冰水中搖勻迅速冷卻至25℃以下，再加入反應(yīng)液，每組反應(yīng)液與對照組的“香草醛-鹽酸”體系同時配制。

在2份冷卻至25℃以下的“6 mL4%香草醛-乙醇溶液+1 mL濃鹽酸”體系中分別加入0.5 mL原花青素對照品溶液及0.5 mL60%乙醇，搖勻，在最大吸收波長下進行反應(yīng)時間與吸光值的動力學掃描，再以花生衣提取液同法試驗，確定合適反應(yīng)時間。

依次以含 1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL 濃鹽酸與6 mL4%香草醛的反應(yīng)體系試驗，反應(yīng)液選擇0.5 mL及1.0 mL對比，比較不同鹽酸用量下吸光值的變化。

依次以含 6 mL3%、4%、5%、6%、7%、8%的香草醛與試驗已確定的濃鹽酸用量的體系實驗，反應(yīng)液同樣選擇0.5 mL及1.0 mL對比，比較不同香草醛濃度下吸光值的變化。

1.3.2.3 標準曲線的繪制

取原花青素對照品20 mg，用60%的乙醇配成1 mg/mL的標準儲備液20 mL，取儲備液用60%的乙醇配制成 0.050 0、0.100 0、0.200 0、0.300 0、0.400 0、0.500 0 mg/mL的原花青素標準系列溶液，以“1.3.2.2”試驗所得適合“香草醛-鹽酸”體系與0.5 mL不同濃度標準溶液依次反應(yīng)，繪制499 nm下濃度與吸光值的標準曲線。

1.3.2.4 精密度及回收率試驗

對本地白花生衣提取液進行5次顯色反應(yīng)試驗，計算方法的精密度。取白、紅花生衣提取樣液的混合液2 mL，加入一定濃度原花青素對照品溶液2 mL，分別對混合樣液、原花青素對照品溶液及二者的混合液進行顯色反應(yīng)，計算方法的回收率。

1.3.2.5 白、紅花生衣中原花青素含量的測定

分別取白、紅花生衣提取液進行顯色反應(yīng)，測定其吸光值，根據(jù)標準曲線所顯示濃度計算含量。

1.3.3 紫外法測定花生衣多酚物質(zhì)含量

1.3.3.1 測定方法

根據(jù)花生衣多酚物質(zhì)及原花青素的60%乙醇溶液在280 nm波長下均有特征吸收峰[8]，將原花青素對照品用 60%乙醇配制成 0.010 0、0.020 0、0.050 0、0.100 0、0.150 0、0.200 0、0.250 0、0.300 0 mg/mL 的系列溶液，制作280 nm波長下標準曲線。以此為對照測定花生衣多酚物質(zhì)濃度。

1.3.3.2 方法回收率試驗

取提取液（本地白花生衣）的稀釋樣液2 mL，再加入一定濃度原花青素對照品溶液2 mL。分別測定稀釋樣液、加入的原花青素對照品溶液以及二者混合液的濃度，計算方法的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香草醛-鹽酸法試驗結(jié)果

2.1.1 顯色反應(yīng)最大吸收波長選擇

通過對顯色反應(yīng)光譜吸收圖像進行峰值檢測見圖1。

圖1 原花青素、花生衣提取液的顯色反應(yīng)光譜圖Fig.1 Color reaction spectrum graph of proanthocyanidin and peanut skin extract

白花生衣提取液在499 nm處，紅花生衣提取液在499nm與500 nm處，原花青素對照品在500 nm處有最大吸收峰，所以測定波長選擇499 nm或500 nm均可，這里選擇499 nm。

2.1.2 反應(yīng)時間的選擇

由吸光值的動力學掃描時間曲線見圖2。

圖2 顯色反應(yīng)吸光值隨時間變化曲線Fig.2 Absorption curve of color reaction with time

由圖2可見，顯色反應(yīng)吸光值隨時間具有以下特點：當產(chǎn)物吸光值＜0.2時，吸光值先隨時間逐漸有所增大，然后再隨時間逐漸減小，吸光值越小，這種現(xiàn)象越明顯；當吸光值＞0.2時，吸光值隨時間而逐漸減小。原花青素的反應(yīng)當吸光值＜0.30時，在270 s～600 s（4.5 min～10 min）時間范圍內(nèi)吸光值較穩(wěn)定，當吸光值＞0.3 時，約在 90～330 s（1.5 min～5.5 min）時間范圍內(nèi)相對穩(wěn)定?；ㄉ绿崛∫悍磻?yīng)吸光值＜0.2時，約在180 s～630 s（3 min～10.5 min）時間范圍內(nèi)吸光值較穩(wěn)定，當吸光值＞0.2 時約在 510 s～780 s（8.5 min～13 min）時間范圍內(nèi)吸光值具有相對穩(wěn)定性，同時從理論上分析原花青素對照品與花生衣原花青素結(jié)構(gòu)的差別，就存在反應(yīng)時間上的差異，為此在做標準曲線或樣品測定中，反應(yīng)時間按照以上規(guī)律在吸光值相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)讀數(shù)，并且吸光值取相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)至少3個點，取平均值。本試驗花生衣提取液吸光值均控制在0.20～0.25之間，每次反應(yīng)均在10、11、12 min時分別讀數(shù)一次，取平均值，標準曲線制作時反應(yīng)均在5 min時讀數(shù)。

2.1.3 鹽酸用量及香草醛濃度的影響

鹽酸用量影響：反應(yīng)中鹽酸用量與吸光值的關(guān)系見圖3。

圖3 鹽酸用量的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid on reaction

由圖3可見，吸光值隨著鹽酸用量的增加而增大，但當鹽酸用量增到3.0 mL時，吸光值不再增大。另外，試驗發(fā)現(xiàn)隨著鹽酸用量增加對照組的比色管的底部也出現(xiàn)淡淡的粉色，搖勻變?yōu)榈S色。

對對照組顏色進行光譜分析見圖4。

圖4 鹽酸與香草醛產(chǎn)生吸光值Fig.4 Absorption from vanillin and hydrochloric acid

由圖4發(fā)現(xiàn)其為在566 nm處有最大吸收的物質(zhì)，但在499 nm處吸光值比較低，另外在顯色反應(yīng)物體系與對照體系中這個吸光值可以相互抵消，所以選擇3.0 mL鹽酸為適合的鹽酸用量。

香草醛濃度影響：香草醛濃度與顯色反應(yīng)產(chǎn)物吸光值的關(guān)系見圖5。

圖5 香草醛濃度的影響Fig.5 Effect of vanillin concentration on reaction

由圖5可見，當香草醛濃度達到5%時吸光值不再增加，或者增加很少，所以香草醛濃度選擇5%為宜。

2.1.4 香蘭素-鹽酸法方法可靠性分析

由2.1.3試驗結(jié)果，當反應(yīng)體系中反應(yīng)液取1.0 mL時，吸光值較大，不便于線性分析，所以反應(yīng)液取0.5 mL，制作標準曲線見圖6。

圖6 顯色反應(yīng)標準曲線Fig.6 Standard curves of proanthocyanidin color reaction

由圖6可知，曲線相關(guān)系數(shù)為0.996 3。精密度和回收率試驗結(jié)果見表1～表2，測得精密度相對標準偏差2.69%，說明該方法的重現(xiàn)性好。通過方法回收率試驗，測得平均回收率為97.22%，符合光譜定量分析的準確度要求。

表1 精密度分析試驗結(jié)果Table 1 Result of precision test

表2 原花青素測定回收率試驗結(jié)果Table 2 Result of recovery test for proanthocyanidin determination

2.1.5 花生衣原花青素含量測定結(jié)果含量測定結(jié)果見表3。

表3 花生衣中原花青素含量Table 3 Proanthocyanidin content in peanut skin

分析試驗結(jié)果具有以下特點：

1）從總體上講，白、紅兩種花生衣中原花青素含量差異不大或基本相近。在超市購買的來自昆明地區(qū)的白花生衣原花青素含量比玉溪本地的白、紅花生衣都明顯高一些，這可能屬于地區(qū)土壤的差異性。

2）本地產(chǎn)新、舊的花生衣所含原花青素也沒有明顯差異。另外試驗對所購買的同一種花生衣進行考察，發(fā)現(xiàn)儲存一年后測得原花青素與一年前幾乎沒有變化，這說明花生衣原花青素在花生儲存過程中十分穩(wěn)定。

2.2 花生衣中多酚物質(zhì)含量分析

通過標準曲線繪制結(jié)果，原花青素對照品溶液的紫外吸收在0～0.200 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，由此測得白、紅花生衣中多酚物質(zhì)含量見表4，回收率試驗結(jié)果見表5。分析以上試驗結(jié)果可知，白、紅兩種花生衣中多酚物質(zhì)含量相差不大。

表4 花生衣中多酚物質(zhì)含量Table 4 Polyphenol content in peanut skin

表5 多酚物質(zhì)測定回收率實驗結(jié)果Table 5 Result of recovery test for polyphenol determination

3 結(jié)論

通過以上試驗，對于香草醛-鹽酸比色法采用優(yōu)化的以“6 mL5%香草醛+3.0 mL鹽酸”體系加入0.5 mL反應(yīng)液，并以反應(yīng)吸光值為最大值時讀數(shù)的方法來測定花生衣中原花青素含量，以及采用多酚物質(zhì)的280 nm紫外吸收法測定花生衣多酚物質(zhì)含量，結(jié)果表明白、紅兩種花生衣中原花青素以及多酚物質(zhì)的含量基本相當，其中多酚物質(zhì)含量較高的花生衣原花青素也含量也高，因此從食品功能學抗氧化的角度來講，這兩種顏色的花生衣抗氧化功能基本相同。香草醛-鹽酸法測得為兒茶素類單體以及其聚合體原花青素的總量，花生衣多酚物質(zhì)中所含成分主要為原花青素類化合物。

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Analysis of Proanthocyanidins and Polyphenols in Peanut Skins

PEI Yun-yi，LU Xing-xing，WU Cui-fang，XU Yan-fei
（Yuxi Agriculture Vocation-Technical College，Yuxi 653106，Yunnan，China）

Vanillin-hydrochloric acid method for determination of proanthocyanidins and UV method for polyphenols in peanut skins were tested and described.For vanillin-hydrochloric acid method，test way was to add 0.5 mL of sample or standard solution to the solution system of 6 mL of 5%vanillin-alcohol and 3 mL of hydrochloric acid，under temperature of 25℃，and absorption was determined at wavelength of 499 nm when absorption was relatively stable.After a series of comparison，the result showed that the content of proanthocyanidins or polyphenols differed little between white and red peanut skins，and that the mainly component of penaut skin polyphenols was proanthocyanidins.

peanut skin；proanthocyanidins；polyphenols

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.032

2016-11-09

玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院課題（2014XY02）

裴云逸（1971—），女（漢），講師，本科，從事實驗儀器分析及食品營養(yǎng)成分研究。