張捷，高靜，趙琢，楊向瑩，劉志鵬，暢曉暉，柳明，槐碩，吳海燕，陳廣全，張錫全

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京100026；2.出入境食品安全檢測(cè)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100026；3.廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，福建廈門361006；4.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308；5.濰坊高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)人民醫(yī)院，山東濰坊261205）

快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光免疫試紙的研制

張捷1，2，高靜3，趙琢4，*，楊向瑩1，2，劉志鵬4，暢曉暉1，2，柳明4，槐碩1，2，吳海燕5，陳廣全1，2，張錫全1，2

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，北京100026；2.出入境食品安全檢測(cè)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100026；3.廈門市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，福建廈門361006；4.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300308；5.濰坊高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)人民醫(yī)院，山東濰坊261205）

研制一種基于低噪聲激發(fā)式熒光沙門氏菌免疫層析檢測(cè)試紙條，用于沙門氏菌快速、高敏、兼顧定性及精準(zhǔn)定量的檢測(cè)。采用低噪聲激發(fā)式熒光染料作為標(biāo)記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于沙門氏菌的免疫層析試紙條。檢測(cè)時(shí)，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測(cè)線，以檢測(cè)線熒光強(qiáng)度檢測(cè)值實(shí)現(xiàn)樣本的定性及定量檢測(cè)，并對(duì)免疫層析試紙條各項(xiàng)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。低噪聲激發(fā)式熒光沙門氏菌免疫層析檢測(cè)試紙條制備成功，免疫層析試紙條性能檢測(cè)結(jié)果顯示，該試紙條特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)限可達(dá)到0.5×103CFU/mL，是一種新型快速高效穩(wěn)定的檢測(cè)方法。該免疫層析試紙條可適用于食品及病理樣本中沙門氏菌初篩和即時(shí)檢測(cè)。

沙門氏菌；免疫層析檢測(cè)試紙條；特異性；靈敏度；檢測(cè)限

沙門氏菌作為致病菌檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均有重要的意義，同時(shí)也對(duì)沙門氏菌的快速及高精度的定量檢測(cè)提出了更高的要求[1]。為探求快速、準(zhǔn)確、高靈敏度、易操作且能夠定量的檢測(cè)方法，世界各國(guó)學(xué)者進(jìn)行了大量研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)、分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)方法，并在實(shí)踐中不斷取得新進(jìn)展[2-3]。

免疫層析技術(shù)是一項(xiàng)有效結(jié)合了層析法卓越分離能力和免疫反應(yīng)高度特異性的新型免疫檢測(cè)技術(shù)，當(dāng)前在疾病快速診斷、環(huán)境污染物分析及致病生物因子檢定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[4]。其原理是將特異抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)遷移至交聯(lián)標(biāo)記抗體的特定區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)標(biāo)記物的顯色、發(fā)光或電化學(xué)反應(yīng)而使該區(qū)域顯示一定的信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)特異性免疫診斷。常用的標(biāo)記物包括生色型探針（包括膠體金、膠體碳、著色微球等）和熒光分子（如有機(jī)熒光染料、量子點(diǎn)、稀土元素配合物、上轉(zhuǎn)磷光顆粒等）[5]。

然而上述的標(biāo)記物卻存在靈敏度有限且無(wú)法實(shí)現(xiàn)精確定量檢測(cè)等缺陷，進(jìn)而限制了免疫層析技術(shù)的廣泛應(yīng)用。如現(xiàn)有技術(shù)中常見(jiàn)的利用酶標(biāo)記催化生色底物的酶促反應(yīng)而顯色，可用于抗原或抗體的直接檢測(cè)，將該方法應(yīng)用于食品中沙門氏菌的檢測(cè)，通過(guò)單克隆抗體大大降低假陽(yáng)性率，但是該方法的靈敏度較分子生物學(xué)方法低，且必須經(jīng)過(guò)增菌篩選純培養(yǎng)步驟，因此難以在短時(shí)間內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果[6]。

對(duì)于現(xiàn)有的膠體金免疫層析技術(shù)，通過(guò)膠體金等納米顆粒的聚集反應(yīng)而顯色，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)果判定。雖然該種方法具有便捷、快速、準(zhǔn)確和無(wú)污染等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)和臨床診斷，在病原體檢測(cè)方面，其敏感性、特異性具有其他免疫學(xué)方法無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，且無(wú)需特殊儀器設(shè)備，對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)要求低，有良好的基層應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。但這種方法中存在標(biāo)記物的穩(wěn)定性較差，顏色單一，靈敏度較低，受基質(zhì)的背景干擾大等缺陷，且只能定性檢測(cè)，不能做到精確定量檢測(cè)，上述標(biāo)記靈敏度有限且無(wú)法實(shí)現(xiàn)精確定量，限制了免疫層析技術(shù)的應(yīng)用。另外，現(xiàn)有免疫層析技術(shù)一直主要用于對(duì)蛋白類的檢測(cè)，對(duì)于微生物的檢測(cè)則所見(jiàn)甚少，同時(shí)更難以實(shí)現(xiàn)微生物的定量檢測(cè)，對(duì)于快速檢測(cè)致病菌而言，其應(yīng)用受到極大的限制[7-8]。

本文所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于現(xiàn)有技術(shù)中難于快速定量檢測(cè)沙門氏菌的問(wèn)題，進(jìn)而提供一種基于低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條。本文采用熒光染料作為標(biāo)記，采用免疫層析技術(shù)，制備靶向于沙門氏菌的免疫層析試紙條，檢測(cè)時(shí)，采用專用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別掃描質(zhì)控線和檢測(cè)線，以檢測(cè)線熒光強(qiáng)度檢測(cè)值實(shí)現(xiàn)樣本的定性及定量檢測(cè)，該試紙條適用于食品及病理樣本中沙門氏菌即時(shí)檢測(cè)，此免疫層析試紙條具有快速、高敏、兼顧定性及精準(zhǔn)定量及便攜的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

XC-CD型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波先倡電子科技有限公司；smartreader101型便攜式近紅外熒光掃描儀：北京博潤(rùn)福得科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 材料與試劑

沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14028、副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802、單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC15313、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌：北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室分離菌株。牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）：北京索萊寶生物科技有限公司；Tween20：北京克勞寧生物科技有限公司；疊氮化鈉：北京新鼎鵬飛科技發(fā)展有限公司；鼠抗沙門氏菌單克隆抗體：上?；墼派?；鼠抗沙門氏菌多克隆抗體：上?；墼派铮坏驮肼暭ぐl(fā)式熒光染料DyLight800：Thermofisher公司；羊抗鼠IgG多克隆抗體：北京華大蛋白質(zhì)公司。

1.2 方法

1.2.1 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)

低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條制備的示意圖，如圖1所示。

圖1 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條示意圖Fig.1 The structure of low-noise excitation fluorescence detection of Salmonella immunochromatographic test dipstick

沿底板7的長(zhǎng)度方向上依次粘附上的樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6。樣品墊1、結(jié)合墊2、抗體承載膜3和吸水墊6之間，依次與且僅與相鄰部位相接觸且部分重疊；抗體承載膜3上粘附于所述底板7的中間部位，其上設(shè)置有相間隔的檢測(cè)線4的質(zhì)控線5，檢測(cè)線4靠近結(jié)合墊2，質(zhì)控線5靠近吸水墊6。質(zhì)控線4與所述檢測(cè)線5平行設(shè)置，檢測(cè)線和質(zhì)控線間距0.5 cm。結(jié)合墊2上噴涂有熒光染料標(biāo)記的鼠抗沙門氏菌單克隆抗體；檢測(cè)線4由可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體鼠抗沙門氏菌多克隆抗體涂層組成；質(zhì)控線5由與沙門氏菌以及可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無(wú)關(guān)的羊抗鼠IgG多克隆抗體涂層形成。

1.2.2 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條制備及使用

1.2.2.1 制備

①取以pH值為7.4的（磷酸緩沖鹽溶液，phosphate buffer saline，PBS）緩沖液稀釋10倍的熒光染料，染料與沙門氏菌單克隆抗體以1∶2質(zhì)量比混合均勻，室溫條件下避光反應(yīng)2 h，隨后將所得的標(biāo)記產(chǎn)物放入含有PBS緩沖液的透析袋中，4℃透析4 h，向所述標(biāo)記好的標(biāo)記產(chǎn)物中添加終濃度為1.5%BSA、0.15%Tween20和0.015%疊氮化鈉，4℃保存，備用；②在玻璃纖維素膜結(jié)合墊上噴涂以層析緩沖液稀釋1 000倍后的上述步驟中的所述標(biāo)記產(chǎn)物，然后室溫風(fēng)干，備用；③使用含 5%BSA，0.1%Tween 20 的 PBS（pH 7.4）緩沖液噴涂在所述纖維素膜樣品墊（結(jié)構(gòu)1），室溫風(fēng)干后，備用；④分別取所述沙門氏菌多克隆抗體和所述與沙門氏菌以及可與沙門氏菌特異性結(jié)合的多克隆抗體均無(wú)關(guān)的抗體用劃線機(jī)在硝酸纖維素抗體承載膜上劃所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線，室溫風(fēng)干，備用；⑤將上述步驟獲得的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述抗體承載膜和所述吸水墊沿所述底板的長(zhǎng)度方向上依次粘附，然后切割成試紙條。

1.2.2.2 使用

以pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋處理待測(cè)樣品，取上清液超聲破菌后作為待檢樣，用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析；熒光掃描所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線，分別測(cè)定所述檢測(cè)線和所述質(zhì)控線區(qū)域的熒光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無(wú)效；若所述檢測(cè)線區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽(yáng)性結(jié)果，反之則為陰性。

1.2.3 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)方法

1.2.3.1 有效性檢測(cè)

取雞肉樣品25 g，剪碎，用225 mL的pH值為7.4的含5%BSA，0.1%Tween 20的PBS緩沖液稀釋樣品，取上清液作為檢樣，吸取1 mL上清液至EP管中，超聲破菌，直徑3 mm探頭，工作5 s，暫停15 s，40%能量，共計(jì)30次循環(huán)，吸取100 μL經(jīng)超聲處理的檢樣滴加到樣品墊1上，待吸收干后再滴加50 μL上述的PBS緩沖液，用所述的試紙條進(jìn)行免疫層析；室溫放置15 min后，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別測(cè)定檢測(cè)線4和質(zhì)控線5區(qū)域的熒光強(qiáng)度，分析結(jié)果。

1.2.3.2 特異性的檢測(cè)

分別取實(shí)驗(yàn)室分離的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌調(diào)制成0.6×104CFU/mL的菌液，檢測(cè)方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 靈敏度和檢測(cè)限的檢測(cè)

采用添加回收試驗(yàn)方法，取未檢出沙門氏菌雞肉樣品75 g，分作3份，分別加入已知濃度的沙門氏菌，剪碎，用225 mL的PBS緩沖液稀釋所述雞肉樣品，吸取1 mL樣本至EP管中，直徑3 mm的探頭，工作5 s，暫停15 s，40%能量，共計(jì)30次循環(huán)。吸取100 μL經(jīng)超聲處理的樣品液滴加到樣品墊1上，室溫靜置10 min，將所述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀中讀數(shù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出沙門氏菌濃度。

在后續(xù)定量檢測(cè)1.2.4.2試驗(yàn)中進(jìn)行，試驗(yàn)方法相同。

1.2.4 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條檢測(cè)沙門氏菌實(shí)例方法

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取105CFU/mL的沙門氏菌純菌（實(shí)驗(yàn)室分離株），用含PBS（pH 7.4）稀釋液將所述純菌進(jìn)行1倍～100倍梯度濃度系列稀釋，制成樣品；然后吸取1 mL上清液至EP管中，超聲破菌，直徑3 mm探頭，工作5 s，暫停15 s，40%能量，共計(jì)30次循環(huán)破菌處理；吸取50 μL樣本滴加到樣品墊1上，待樣品吸收后再滴加50 μL上述的PBS緩沖液，室溫靜置10 min，將上述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀中讀數(shù)。

稀釋的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行有效性檢測(cè)，掃描獲得檢測(cè)線4和質(zhì)控線5的熒光值，如若反應(yīng)正常后可繼續(xù)進(jìn)行。每個(gè)稀釋度樣本平行測(cè)量?jī)纱?，取平均值作為測(cè)量值，記錄檢測(cè)結(jié)果，以該值對(duì)相應(yīng)的樣品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并擬合方程。

1.2.4.2 定量檢測(cè)的步驟

定量檢測(cè)方法與1.2.3.3試驗(yàn)方法相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

2.1.1 有效性

利用低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條對(duì)雞肉樣品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，用便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀分別測(cè)定所述檢測(cè)線4和所述質(zhì)控線5區(qū)域的熒光強(qiáng)度，若所述質(zhì)控線5區(qū)域出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，則表明該試紙條有效，反之則無(wú)效；若所述檢測(cè)線4區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)熒光發(fā)射峰則為陽(yáng)性結(jié)果，反之則為陰性，結(jié)果如圖2所示。

圖2 免疫層析試紙有效性測(cè)試Fig.2 The effectiveness test of immunochromatographic dipstick

如圖2所示，給出上述樣品的定性檢測(cè)結(jié)果，在檢測(cè)線4區(qū)域和控制線5區(qū)域同時(shí)出現(xiàn)熒光發(fā)射峰，反應(yīng)為陽(yáng)性結(jié)果，該樣品中含有沙門氏菌，證明該低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條是可用的，具有有效性。

2.1.2 特異性

利用低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條對(duì)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌和副溶血弧菌進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 免疫層析試紙?zhí)禺愋詼y(cè)試Fig.3 The specificity test of immunochromatographic dipstick

由圖3可以看出，除沙門氏菌樣品外，其余檢測(cè)的細(xì)菌在檢測(cè)線位置均未出現(xiàn)發(fā)射峰，各菌的試紙條均在質(zhì)控線處出現(xiàn)發(fā)射峰，表明本方法對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)特異性好，與其他4個(gè)菌屬無(wú)交叉反應(yīng)。

2.1.3 靈敏性

低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條，其發(fā)射光譜位于低噪聲激發(fā)式區(qū)域（波長(zhǎng)為650 nm～1100 nm）的低噪聲激發(fā)式熒光探針具有較高的信噪比，并由此保障了其高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)由于生物基體極少在低噪聲激發(fā)式光譜區(qū)自發(fā)熒光，使得基于此類探針標(biāo)記的分析檢測(cè)免受背景熒光干擾；因散射光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方成反比，發(fā)射光位于長(zhǎng)波區(qū)的低噪聲激發(fā)式熒光探針受其干擾小[9-10]。與常用的膠體金免疫層析試紙條相比，基于低噪聲激發(fā)式熒光染料標(biāo)記的免疫層析體系對(duì)靶標(biāo)菌的靈敏度提高約200倍。利用低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條對(duì)雞肉樣品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，并與已知濃度進(jìn)行比對(duì)，在2.3.2試驗(yàn)中得到論證，結(jié)果如表2所示，證明采用的基于熒光標(biāo)記法測(cè)定的沙門氏菌的濃度較為準(zhǔn)確、靈敏性好，可用于日常沙門氏菌的檢測(cè)之用。

2.1.4 檢測(cè)限

沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為1×105CFU/mL[11]，而本研究中基于低噪聲激發(fā)式熒光染料的沙門氏菌免疫層析試紙條的最低檢出限為0.5×103CFU/mL，檢測(cè)線明顯低于沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條。

2.2 低噪聲激發(fā)式熒光標(biāo)記的沙門氏菌免疫層析試紙條定量檢測(cè)沙門氏菌的實(shí)例

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稀釋的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品：1×105、0.5×105、1×104、0.5×104、1×103、0.5×103、1×102、10 CFU/mL 的樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，掃描獲得檢測(cè)線4和質(zhì)控線5的熒光值，同時(shí)出現(xiàn)檢測(cè)區(qū)域熒光峰和質(zhì)控區(qū)域熒光峰方表明反應(yīng)正常。每個(gè)稀釋度樣本平行測(cè)量?jī)纱危∑骄底鳛闇y(cè)量值，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同濃度沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of suspension of Salmonella with different concentrations

以該測(cè)量值對(duì)相應(yīng)的樣品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖4所示，并擬合得適用的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.492 7x+2.573 8，R2=0.941 6。

圖4 沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Fig.4 The standard curve of Salmonella

2.2.2 沙門氏菌的定量檢測(cè)

采用添加回收試驗(yàn)方法，取未檢出沙門氏菌雞肉樣品進(jìn)行添加已知濃度的沙門氏菌操作，最后將所述試紙條放入便攜式低噪聲激發(fā)式熒光掃描儀中讀數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的沙門氏菌的濃度Table 2 Calculate the concentration of Salmonella in the sample according to the standard curve

由上述表格數(shù)據(jù)可知，與已知的沙門氏菌的濃度相比，樣品1在已知濃度為0.7×104CFU/mL時(shí)，免疫層析試紙檢測(cè)濃度為0.66×104CFU/mL；樣品2在已知濃度為0.5×104CFU/mL時(shí)，免疫層析試紙檢測(cè)濃度為5.5×103CFU/mL；樣品3在已知未添加沙門氏菌時(shí)，免疫層析試紙未檢測(cè)出。由此本研究研制的基于熒光標(biāo)記法測(cè)定的沙門氏菌的濃度試紙條較為準(zhǔn)確，可用于日常沙門氏菌的檢測(cè)使用。

3 討論

沙門氏菌作為致病菌檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，在世界各國(guó)細(xì)菌性食物中毒病例中，沙門氏菌引起的食物中毒案例常居榜首或第二位[12-13]。在公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和出入境檢驗(yàn)檢疫中均有重要的意義，同時(shí)也對(duì)沙門氏菌的快速及高精度的定量檢測(cè)提出了更高的要求。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法耗時(shí)、操作繁瑣，而基于免疫學(xué)原理的產(chǎn)品存在檢測(cè)限高、特異性不強(qiáng)等問(wèn)題[14-16]。近紅外檢測(cè)方法與其他檢測(cè)方法相比，信噪比高，靈敏度理想。與常用的膠體金免疫層析試紙條相比，基于近紅外熒光染料標(biāo)記的免疫層析體系對(duì)靶標(biāo)菌的靈敏度提高約100倍。如沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條的最低檢出限為1×105CFU/mL[11]，而本研究中基于近紅外熒光染料的沙門氏菌免疫層析試紙條的最低檢出限為0.5×103CFU/mL。

傳統(tǒng)的免疫層析法依賴膠體金顆粒的聚集效應(yīng)而生色以判讀結(jié)果，其顏色深淺雖與樣品中靶標(biāo)菌的濃度存在一定的數(shù)量關(guān)系，但無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量[17-18]。近紅外檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)在于便攜，適用于現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)、快速檢測(cè)。本方法所涉的免疫層析試紙條及近紅外熒光掃描儀均屬于便攜可移動(dòng)裝置，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在45 min內(nèi)完成，適用于現(xiàn)場(chǎng)、即時(shí)、快速檢測(cè)。相對(duì)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法需要5 d～6 d的檢測(cè)周期及繁瑣的培養(yǎng)基配制等過(guò)程具有顯著的時(shí)效性優(yōu)勢(shì)；相對(duì)于PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等分子生物學(xué)法在儀器的檢測(cè)速度、便攜性及現(xiàn)場(chǎng)適用性上呈明顯優(yōu)勢(shì)。

綜上，本研究所建立的近紅外熒光染料檢測(cè)方法，既降低了檢測(cè)限，又縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了食源性致病菌的檢測(cè)效率，為進(jìn)出口食品的快速檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)方法。

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Development of An Immunochromatographic Test Dipstick for Detection of Salmonella

ZHANG Jie1，2，GAO Jing3，ZHAO Zhuo4，*，YANG Xiang-ying1，2，LIU Zhi-peng4，CHANG Xiao-hui1，2，
LIU Ming4，HUAI Shuo1，2，WU Hai-yan5，CHEN Guang-quan1，2，ZHANG Xi-quan1，2
（1.Beijing Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau Inspection Quarantine Technical Center，Beijing 100026，China；2.Beijing Key Laboartory of Entry-Exit Food Safty Testing，Beijing 100026，China；3.Xiamen Products Quality Supervision&Inspection Institute，Xiamen 361006，F(xiàn)ujian，China；4.Technical Center for Safety of Industrial Products，Tianjin Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China；5.Weifang People's Hospital of High-tech Industrial Development Zone，Weifang 261205，Shandong，China）

A rapid and accurate detection product was developed for Salmonella with a low-noise excitation fluorescence detection of Salmonella immunochromatographic test dipstick.The immune-chromatography paper strips were prepared by using immunochromatography，a low-noise，high-emission fluorescent dye.In inspection，special portable low noise excitation fluorescent scanner was uesd to detected control line and test line respectively，the fluorescence intensity detected value of the line can achieve qualitative and quantitative detection of samples.The low-noise excitation fluorescence detection of Salmonella immunochromatographic test dipstick prepared successfully.Immunochromatographic dipstick performance test results show that the test dipstick specificity，high sensitivity，limit of detection was 0.5×103CFU/mL.It was a new fast and efficient and stable detection tools.The immunochromatographic dipstick can be applied immediately detect Salmonella in food samples and pathology.

Salmonella；immunochromatographic test dipstick；specificity；sensitivity；detection limit

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.027

2016-12-11

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（201410049）；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK011）

張捷（1965—），男（漢），高級(jí)工程師，博士，研究方向：食品安全評(píng)價(jià)。

*通信作者：趙琢，高級(jí)工程師，博士。