曹雪丹，郭小，陳林星，方修貴，趙凱，李二虎

（1.浙江省柑橘研究所，浙江臺(tái)州318026；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

益生菌發(fā)酵甌柑汁及主要抗氧化成分研究

曹雪丹1，郭小2，陳林星2，方修貴1，趙凱1，李二虎2

（1.浙江省柑橘研究所，浙江臺(tái)州318026；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070）

選用益生菌（副干酪乳桿菌）在微量需氧的條件下對(duì)甌柑汁進(jìn)行益生菌發(fā)酵，發(fā)酵溫度36℃，時(shí)間10 d。在發(fā)酵前后對(duì)活菌數(shù)、pH值和可溶性固形物含量及主要抗氧化成分進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：通過(guò)發(fā)酵，活菌數(shù)由初始的（5.6±0.20）log CFU/mL顯著增加至（7.2±0.30）log CFU/mL，pH值和可溶性固形物含量則顯著降低（p＜0.05）；同時(shí)，總酚含量顯著升高（p＜0.05），總類胡蘿卜素和4種主要黃酮類化合物含量均顯著下降（p＜0.05）；各黃酮類化合物的減少幅度由大到小依次為：橙皮苷＞柚皮苷＞枸橘苷＞新橙皮苷。常溫貯藏10 d對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的影響不大，且活菌數(shù)仍然保持在較高水平。可見(jiàn)，甌柑汁適宜研制益生菌發(fā)酵型果汁飲品。

副干酪乳桿菌；甌柑；發(fā)酵；抗氧化成分

甌柑（Citrus suavissima Hort.ex Tanaka）是分布在浙江省第二大水系——甌江沿岸的特色水果，在溫州地區(qū)已有上千年的栽培歷史[1]。由于甌柑具有祛熱生津、化痰止咳、清涼解毒等特殊的醫(yī)藥效能，所以在民間常把甌柑與解熱鎮(zhèn)痛的中藥“羚羊角”相提并論。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，甌柑不但含有豐富的維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有大量的黃酮類化合物以及酚類物質(zhì)和類胡蘿卜素等抗氧化活性功能成分。如張九凱[2]從甌柑果實(shí)中鑒定出8種黃酮類化合物，包括4種黃烷酮糖苷（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷）和4種多甲氧基黃酮（甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素）；朱曉艷[3]測(cè)定了甌柑中總酚及6種主要的黃酮類化合物（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、川陳皮素和橘皮素）含量及其抗氧化活性的變化規(guī)律等。相比于大多數(shù)柑橘而言，類黃酮等抗氧化成分才是甌柑主要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值所在。但甌柑果實(shí)滋味較淡，且略顯苦澀，無(wú)論鮮食還是加工成果汁都與主流的柑橘或橙汁存在較大的口感差異。

益生菌（Probiotics）是指一類對(duì)生命或健康有益的微生物，主要包括細(xì)菌和真菌等。世界衛(wèi)生組織（WHO）明確指出發(fā)酵制品中的益生菌活菌數(shù)達(dá)到7.0 Log CFU/mL就能對(duì)人體產(chǎn)生積極的影響，而且通過(guò)益生菌發(fā)酵還可以保持或改善果蔬的營(yíng)養(yǎng)及感官特性[4]，如Yu等[5]采用乳酸菌發(fā)酵的方法改良了新會(huì)茶枝柑（Citrus reticulate cv.chachiensis）果汁的口感，提高了糖酸比例。本文選用在人體腸道中具有較強(qiáng)定植能力的副干酪乳桿菌為原料，采用不添加外來(lái)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法進(jìn)行甌柑汁的益生菌發(fā)酵，并對(duì)不同發(fā)酵階段甌柑汁中的活菌數(shù)和總酚、總胡蘿卜素和類黃酮等主要抗氧化成分進(jìn)行初步研究，以期為豐富甌柑加工制品、開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)型甌柑發(fā)酵汁提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甌柑：產(chǎn)自浙江省溫州市，由浙江森馬生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；發(fā)酵劑（副干酪乳桿菌Lpc-37）：德國(guó)丹尼斯克（Danisco）公司；柚皮苷（≥98%）、橙皮苷（≥98%）、新橙皮苷（≥98%）和枸橘苷（≥98%）：美國(guó)斯坦福（Stanford）分析化學(xué)公司；MRS培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）等：美國(guó)天地（Tedia）公司；福林-酚試劑：上海荔達(dá)生物科技有限公司；沒(méi)食子酸（≥98%）：上海伊卡生物技術(shù)有限公司；β-胡蘿卜素（≥98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

MJ-176NR型榨汁/攪拌機(jī)：日本松下（Panasonic）電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社；BHS-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋：福州泰美試驗(yàn)儀器有限公司；LC-20型高效液相色譜儀（帶SPD-M20A型PDA檢測(cè)器）：日本島津（Shimadzu）公司；Biospecrtometer紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)：德國(guó)艾本德（Eppendorf）公司；玻璃伏菜壇：市售；FG2型便攜式pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多（Mettler-Toledo）公司；PAL-3型手持式數(shù)顯糖度計(jì)：日本愛(ài)宕（Atago）公司；LabServ CO150型CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)熱電（Thermo）公司。

1.2 甌柑汁的發(fā)酵

先將新鮮甌柑剝?nèi)スげ⑻蕹N子，再用家用榨汁機(jī)打成漿狀經(jīng)80目紗布過(guò)濾，加熱至70℃保溫5 min后移入玻璃伏菜壇中，靜置冷卻至室溫（20±1）℃，準(zhǔn)確稱取并投放發(fā)酵劑，攪拌均勻后發(fā)酵0 d并取樣，將壇口加水密封并于36℃水浴中保溫發(fā)酵10 d后取樣，再于室溫下后貯藏10 d再次取樣。

1.3 活菌數(shù)的檢測(cè)

采用平板計(jì)數(shù)法[6]。先將甌柑汁樣品充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取25 mL放入裝有225 mL 0.85%生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，搖勻即為10倍稀釋液。再將此稀釋液選擇2個(gè)～3個(gè)適宜的稀釋度，各以0.1 mL加入到MRS平板進(jìn)行涂布，置于36℃的CO2培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h，進(jìn)行計(jì)數(shù)。重復(fù)3次，取平均值。

1.4 pH值和可溶性固形物（TSS）的測(cè)定

分別采用pH計(jì)法和折光計(jì)法。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 總酚的測(cè)定

采用福林-酚比色法[7]。稱取3 mL甌柑汁樣品，用20 mL 80%甲醇研磨攪拌，在4℃下浸提12 h以上，于8 000 r/min離心 20 min，過(guò)濾，洗渣，定容至 25 mL，即為樣品提取液，-22℃凍存待測(cè)。

1.6 總類胡蘿卜素的測(cè)定

采用比色法[8]。取10 mL甌柑汁樣品加入20 mL的混合有機(jī)溶劑（正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1，體積比），經(jīng)磁力攪拌30 min后在，于5℃下6 500 r/min離心5 min，取上層清液待測(cè)[9]。

1.7 黃酮類化合物的測(cè)定

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)液制備

準(zhǔn)確稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷的標(biāo)準(zhǔn)品各20.0 mg，分別用乙腈充分溶解并定容至100 mL，即得濃度為200.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，再經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，備用。

1.7.2 樣品的制備

取甌柑汁樣品在3 000 r/min下離心20 min，準(zhǔn)確移取5 mL上清液于容量瓶中，并用乙腈定容至10 mL。超聲振蕩處理10 min，再經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，待測(cè)。

1.7.3 HPLC色譜條件

采用 Agilent C18柱（TC，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相為水和乙腈，洗脫梯度為：0～4 min，保持乙腈15%不變；4 min～12 min，乙腈 15%～50%；12 min～16 min，保持乙腈50%不變；16 min～18 min，乙腈50%～15%；18 min～22 min，保持乙腈15%，至循環(huán)結(jié)束。流速0.7 mL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm[10]。

1.7.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確移取柚皮苷、橙皮苷和枸橘苷標(biāo)準(zhǔn)液1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mL（新橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)液 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mL）于 50 mL 容量瓶中，乙腈定容，在相同條件下進(jìn)行HPLC測(cè)定。以標(biāo)樣的濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（LSD法），用EXCEL軟件繪圖。

圖1 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of naringin，hesperidin，neohesperidin and poncirin

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌發(fā)酵甌柑汁中活菌數(shù)及pH值和TSS含量的變化

Lpc-37副干酪乳桿菌是近年來(lái)國(guó)外研究較多的一種益生乳酸細(xì)菌，這類菌廣泛的存在于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品和人體胃腸道中，還有少量報(bào)道表明也可從泡菜、發(fā)酵豆制品、發(fā)酵魚(yú)制品以及一些酒類如低度清酒和白蘭地中分離得到該菌種[11]。王德純等[12]指出Lpc-37能夠耐受較低的pH值環(huán)境，具有很強(qiáng)的黏附人體上皮細(xì)胞系能力，通過(guò)人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)該種副干酪乳桿菌可以提高特異性免疫球蛋白LgG的感應(yīng)能力，維持宿主胃腸道中雙歧桿菌的平衡，并改善其微生態(tài)環(huán)境[13]。本文分別在發(fā)酵0 d、保溫發(fā)酵10 d和常溫貯藏10 d 3個(gè)不同階段取樣檢測(cè)甌柑汁中的活菌數(shù)、pH值和TSS含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同發(fā)酵階段甌柑汁中活菌數(shù)的變化Table 1 Changes of the viable count in different stage during fermentation with Lactobacillus paracasei

活菌數(shù)是決定益生菌發(fā)酵制品功能特性的關(guān)鍵因素。在發(fā)酵初始，甌柑汁中的副干酪乳桿菌接種濃度約為（5.6±0.20）log CFU/mL。在36℃下保溫發(fā)酵10 d后活菌數(shù)顯著升高至（7.2±0.30）log CFU/mL（p＜0.05），即達(dá)到了WHO組織的建議濃度：7.0 log CFU/mL。在室溫條件下繼續(xù)貯藏10天后，活菌數(shù)顯著降低（p＜0.05）。這一趨勢(shì)與Filannino P等[14]使用3種不同乳酸菌于30℃下發(fā)酵（5 d）和4℃下貯藏（30 d）石榴汁所測(cè)得活菌數(shù)變化規(guī)律相似。

通過(guò)10 d保溫發(fā)酵，pH值和TSS含量相比初始值顯著降低（p＜0.05）；常溫貯藏10 d后甌柑汁pH值未發(fā)生明顯的變化，但是TSS含量卻顯著下降（p＜0.05），這可能是由于發(fā)酵結(jié)束后甌柑汁中的活菌在常溫條件下仍然能夠繼續(xù)緩慢生長(zhǎng)和代謝消耗所致。

2.2 益生菌發(fā)酵甌柑汁中主要抗氧化成分含量的變化

柑橘類水果通常含有較高的抗氧化活性物質(zhì)[15]，這些抗氧化成分主要包括類胡蘿卜素[16]、多酚[17]、黃酮[18]及花色苷[19]等，具有防止心血管疾病、延緩衰老、抑制癌癥發(fā)生等生理作用[20]。本文分別在發(fā)酵0 d、保溫發(fā)酵10 d和常溫貯藏10 d 3個(gè)不同階段取樣檢測(cè)甌柑汁中的總酚、總類胡蘿卜素和4種主要黃酮類化合物含量，結(jié)果如表2所示。

酚類物質(zhì)是柑橘果實(shí)中一類主要的次生代謝產(chǎn)物，不僅有著重要的生理功能，而且可能是柑橘果實(shí)抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者之一[21]。由表2可知，發(fā)酵后甌柑汁中總酚含量顯著升高（p＜0.05），且維持在發(fā)酵前的約1.3倍水平至貯藏結(jié)束時(shí)也沒(méi)有明顯降低，這可能會(huì)對(duì)甌柑汁的抗氧化活性產(chǎn)生積極的影響。而總類胡蘿卜素含量在發(fā)酵過(guò)程中損失殆盡，具體原因和對(duì)甌柑汁抗氧化活性的影響尚待進(jìn)一步研究。

4種主要存在于甌柑果肉中的黃酮類化合物分別為：柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷，其中新橙皮苷為甌柑中最主要的黃酮類化合物，含量達(dá)到591.52 mg/L～692.42 mg/L，這與張九凱[2]、朱曉艷[3]的研究結(jié)果相一致。枸橘苷是甌柑特有的黃酮類化合物，僅在葡萄柚和胡柚中檢測(cè)出較低含量，在臍橙、檸檬和溫州蜜柑等均未檢出[3]。但是經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，這4種黃酮類化合物含量均顯著降低（p＜0.05），而在常溫條件下貯藏10 d的變化并不明顯（除新橙皮苷外）。其中橙皮苷在發(fā)酵過(guò)程中損失最大，含量減少了近1/2；而新橙皮苷含量在發(fā)酵過(guò)程中僅減少了約8%左右，柚皮苷和枸橘苷分別減少了約30%和25%；至貯藏結(jié)束時(shí)，新橙皮苷含量仍保持在發(fā)酵初始值的85.40%，維持了較高的水平。

表2 不同發(fā)酵階段甌柑汁中主要抗氧化成分含量的變化Table 2 Changes of the main antioxidants content in different stage during fermentation with Lactobacillus paracasei

3 結(jié)論

副干酪乳桿菌（Lpc-37）可在甌柑汁中正常發(fā)酵，且通過(guò)36℃保溫發(fā)酵10 d后活菌數(shù)由初始的（5.6±0.20）log CFU/mL 顯著增加至（7.2±0.30）log CFU/mL，pH值和TSS含量則顯著降低（p＜0.05），在常溫條件下貯藏10 d也無(wú)明顯變化。甌柑汁發(fā)酵前后除總酚含量顯著升高外，總類胡蘿卜素和4種主要黃酮類化合物含量均顯著下降（p＜0.05），其中總類胡蘿卜素含量幾乎消耗殆盡，而各黃酮類化合物的減少幅度也有所差異，降幅大小依次為：橙皮苷＞柚皮苷＞枸橘苷＞新橙皮苷。

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Research on Probiotics Fermentation Pleasant Orange Juice and the Main Antioxidant Components

CAO Xue-dan1，GUO Xiao2，CHEN Lin-xing2，F(xiàn)ANG Xiu-gui1，ZHAO Kai1，LI Er-hu2
（1.Zhejiang Citrus Research Institute，Taizhou 318026，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，Hubei，China）

In this research，production of probiotic pleasant orange juice through its fermentation by lactic acid bacteria （Lactobacillus paracasei）was examined.Fermentation was carried out at 36℃ for 10 d under microaerophilic conditions.Viability counts，pH，total soluble solid and the main antioxidant components were measured in the before and after fermentation.The result indicated that viability counts increased to（7.2±0.30）log CFU/mL from （5.6±0.20）log CFU/mL after 10 d of fermentation，pH and total soluble solid were significantly reduced（p＜0.05），and total phenol content increased significantly（p＜0.05），total carotenoid and four major flavonoids were significantly reduced （p＜0.05）.The reduction of flavonoids from large to small in order：hesperidin＞naringin＞poncirin＞neohesperidin.There was no significant effect on the indicators for 10 d of storage at room temperature，and the number of viable cells remained at a relatively high level.Therefore，pleasant orange juice was proved to be a suitable media for production of a femented probiotic drink.

Lactobacillus paracasei；pleasant orange；fermentation；antioxidant components

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.024

2017-06-14

曹雪丹（1980—），男（漢），助理研究員，碩士，研究方向：果品貯藏及加工。