劉威，閔偉紅，*，劉春雷，曹柏營(yíng)，趙凡睿

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

核桃清蛋白抗氧化肽的制備及其活性研究

劉威1，2，閔偉紅1，2，*，劉春雷1，2，曹柏營(yíng)1，2，趙凡睿1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；2.小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春130118）

以核桃清蛋白為原料，用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解制備抗氧化肽，通過單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)，分析確定制備核桃清蛋白抗氧化肽的最佳工藝條件為：pH9.5，溫度45℃，底物濃度4%，加酶量8 000 U/g，酶解時(shí)間2.5 h。對(duì)最優(yōu)條件下制備的抗氧化肽進(jìn)行活性研究，測(cè)定其Fe2+螯合能力及對(duì)羥基自由基、DPPH·、ABTS+·3種自由基的清除能力，結(jié)果表明核桃清蛋白抗氧化肽對(duì)幾種自由基均有顯著的清除作用和金屬離子螯合能力，是一種活性的的天然抗氧化劑。

核桃清蛋白；酶解優(yōu)化；抗氧化活性

研究表明，許多疾病可稱為“自由基”疾病，能否有效地清除自由基成為解決各類疾病的關(guān)鍵問題。近年來藥食同源植物受到廣泛的重視，開發(fā)植物資源的功能活性提取成分及保健食品具有巨大潛力及應(yīng)用價(jià)值，且開發(fā)具有抗氧化活性的植物提取物用以預(yù)防和治療氧化及自由基引發(fā)的疾病，減少心腦血管疾病、腫瘤及機(jī)體老化引發(fā)的各類疾病的發(fā)病率具有重要的意義[1-2]。

長(zhǎng)白山核桃仁蛋白含量一般為14%～17%，最高可達(dá)29.7%，消化率可達(dá)85%以上[3-4]，核桃蛋白效價(jià)與動(dòng)物蛋白相近，是一種良好的植物蛋白質(zhì)。其中清蛋白占核桃蛋白的40%左右，是一種水溶性蛋白。本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解制備核桃清蛋白抗氧化肽進(jìn)行工藝優(yōu)化，并在此基礎(chǔ)上研究其抗氧化活性，為核桃蛋白的充分利用和核桃多肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。與人工合成的抗氧化劑相比，通過酶解植物蛋白得到的抗氧化肽更受到人們的青睞[5-7]，它們具有易于被人體吸收、安全無副作用的特點(diǎn)，所以植物抗氧化肽的開發(fā)和應(yīng)用前景十分廣闊[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃清蛋白：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室自制（參照Tan的方法[9]）。

DPPH、ABTS、菲洛嗪：sigma公司；堿性蛋白酶2.4 L（酶活力45 642 U/mL）：諾維信生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 核桃清蛋白抗氧化肽的制備

核桃清蛋白溶液進(jìn)行均質(zhì)，90℃水浴鍋內(nèi)水浴15 min，冷卻至酶解溫度，用NaOH（0.5 mol/mL）調(diào)節(jié)蛋白溶液到一定pH值，加入定量堿性蛋白酶，酶解一定時(shí)間（此過程用NaOH調(diào)節(jié)pH值），酶解結(jié)束后，在90℃水浴鍋內(nèi)水浴15 min進(jìn)行滅酶處理，用NaOH調(diào)節(jié)蛋白溶液到pH值至7，5 000 r/min離心10 min，取上清，冷凍干燥后得到核桃清蛋白抗氧化肽。

1.2.2 水解度（DH）測(cè)定

水解度的測(cè)定采用pH-stat法[10]

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶解物的羥基自由基清除能力為指標(biāo)。底物濃度 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 g/mL，溫度 40、45、50、55、60 ℃，加酶量 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 U/g（以干基計(jì)），pH 值 7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5， 酶 解 時(shí) 間 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃清蛋白抗氧化肽酶解制備工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選出影響較大的3個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，開展三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理均利用Design Expert 8.0.5軟件完成，試驗(yàn)因素及水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.2.5 核桃清蛋白抗氧化肽抗氧化性的測(cè)定

1.2.5.1 羥基自由基（·OH）清除作用的測(cè)定

參照Amarowicz的試驗(yàn)方法[11]。

沒有什么值得敬服之處的蘇州園林，毫無“月落烏啼”詩意的寒山寺，這些現(xiàn)實(shí)擊碎了芥川腦海里由古詩詞所構(gòu)建的浪漫唯美的中國(guó)形象，作為“中國(guó)趣味的愛好者”，當(dāng)他來到中國(guó)，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)實(shí)中的中國(guó)與古詩詞中的中國(guó)之間的反差時(shí)，失望之情溢于言表。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除作用的測(cè)定

參照Kong的試驗(yàn)方法[12]。

1.2.5.3 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Xie的試驗(yàn)方法[13]。

1.2.5.4 Fe2+螯合能力的測(cè)定

參照Yu-Ling Lee的試驗(yàn)方法[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)酶解時(shí)間、pH值、加酶量、底物濃度、水解溫度進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，見圖1～圖5。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on scavenging capacities against hydroxyl radical and DH

圖2 pH值對(duì)羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.2 Effect of pH on scavengin capacities against hydroxyl radical and DH

根據(jù)圖1～圖5所示，當(dāng)羥基自由基清除能力和水解度兩種指標(biāo)上升及下降趨勢(shì)一致時(shí)，單因素，結(jié)果比較容易確定，當(dāng)兩種指標(biāo)趨勢(shì)不一致時(shí)，綜合考慮兩種指標(biāo)，由于試驗(yàn)重點(diǎn)是測(cè)定蛋白及其水解多肽的抗氧化性質(zhì)，所以測(cè)定考慮其對(duì)羥基自由清除能力這一指標(biāo)的考察，可以得到時(shí)間2.5 h、pH9.0、加酶量為8 000 U/g、底物濃度3%、水解溫度50℃為最佳水解條件，選取其中影響較大的水解溫度、pH值、底物濃度三因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

圖4 底物濃度對(duì)羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on scavenging ca-pacities against hydroxyl radical and DH

圖5 酶解溫度對(duì)羥基自由基清除能力和水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on reducing power and DH

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化核桃清蛋白酶解工藝

2.2.1 模型的建立與分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

以羥基自由基清除能力為響應(yīng)值進(jìn)行了回歸模擬方差分析，結(jié)果見表3。以下為以羥基自由基清除能力為響應(yīng)值回歸擬合所得各因素函數(shù)表達(dá)：

羥基自由基清除能力（%）=-717.83+87.445A+10.301 5B+75.452 5C-1.474AB-1.8AC-0.305BC-0.39A2+0.038 3B2-5.477 5C2

由方差分析得出P值，模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.942 9，修正決定系數(shù)，說明方程擬合性較好，可以應(yīng)用于對(duì)酶解條件的分析預(yù)測(cè)。根據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析：一次項(xiàng)C極顯著，二次項(xiàng)C2極顯著。說明該模型擬合程度較好，用該模型對(duì)酶解制備核桃抗氧化肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化是合適的，得到最優(yōu)的酶解工藝條件為：pH9.5，溫度45℃，底物濃度4%，加酶量8 000 U/g，酶解時(shí)間2.5 h。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results for response surface analysis

表3 回歸模擬方差分析Table 3 Regression and the analysis of variance

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最優(yōu)條件下對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，羥基自由基清除能力77.03%，接近預(yù)測(cè)值（79.56%）。與理論值無顯著性差異（P>0.05），表明試驗(yàn)所得模型具有實(shí)際價(jià)值。

2.3 核桃清蛋白抗氧化肽抗氧化性的測(cè)定

2.3.1 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+自由基，有自由基清除劑存在時(shí)，ABTS+·的產(chǎn)生會(huì)被抑制，測(cè)定吸光度即可得出樣品清除ABTS+自由基的能力見圖6。

圖6 清蛋白抗氧化肽、VC對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of albumin antioxidant peptide and VCwith ABTS+radical

如圖6所示，清蛋白抗氧化肽對(duì)ABTS+自由基的清除率隨濃度的增大不斷升高，當(dāng)濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除效果達(dá)到（74.37±1.5）%，對(duì)ABTS+自由基的清除能力高于松子抗氧化肽（60%，1 mg/mL）、經(jīng)胰液素酶水解脫脂核桃粉蛋白質(zhì)得到的水解物[（69.21±7.66）%，0.5 mg/mL][15-16]。

2.3.2 DPPH自由基清除能的測(cè)定

試驗(yàn)中以VC為陽性對(duì)照，測(cè)定不同濃度時(shí)VC及多肽對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖7。

圖7 清蛋白抗氧化肽、VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of albumin antioxidant peptide and VCwith DPPH radical

如圖7所示，清蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而升高，表現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系，并在0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到（92.63±1.83）%，高于經(jīng)胰液素酶水解脫脂核桃粉蛋白質(zhì)得到的水解物[（87.79±1.49）%，2.0 mg/mL]、谷胱甘肽[（94.83±0.35）%，2.0 mg/mL]、核桃分離蛋白酶解產(chǎn)物（90.08%，1.2 mg/mL）[16-17]。

2.3.3 羥基自由基（·OH）清除作用的測(cè)定

羥基自由基是人體內(nèi)危害性最大的自由基。在反應(yīng)過程中，亞鐵離子與雙氧水釋放出的羥基自由基會(huì)與水楊酸結(jié)合，形成紫色物質(zhì)。有自由基清除劑存在時(shí)，紫色會(huì)褪去，從褪色程度可以判斷其清除自由基能力的強(qiáng)弱見圖8。

圖8 清蛋白抗氧化肽、VC對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of albumin antioxidant peptide and VCwith hydroxyl radical

如圖8所示，清蛋白抗氧化肽對(duì)羥基自由基的清除作用隨濃度的增加而顯著提高，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，清除率到達(dá)84.07%，高于核桃分離蛋白酶解產(chǎn)物（94.56%，15 mg/mL）、松子抗氧化肽（32.15%，8 mg/mL）[17，15]。

2.3.4 Fe2+螯合能力的測(cè)定

亞鐵離子的存在，會(huì)加速脂質(zhì)氧化的過程，所以測(cè)定對(duì)金屬離子的螯合能力可以衡量出樣品的抗氧化能力見圖9。

圖9 清蛋白氧化肽、EDTA對(duì)Fe2+的螯合能力作用Fig.9 Ferrous ions chelating capacity of albumin antioxidant peptide and EDTA

如圖9所示，清蛋白抗氧化肽對(duì)Fe2+的螯合能力呈現(xiàn)良好的劑量關(guān)系，濃度僅為0.5 mg/mL時(shí)螯合率為89.65%，高于經(jīng)胰液素酶水解脫脂核桃粉蛋白質(zhì)得到的水解物[74.00±2.03%，2.0（mg/mL）][16]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以核桃清蛋白為原料，用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解制備抗氧化肽的最佳工藝條件為：pH9.5，溫度45℃，底物濃度4%，加酶量8 000 U/g，酶解時(shí)間2.5 h，此條件下水解度為28.68%，羥基自由基清除能力73.34%。

試驗(yàn)考察了酶解制備的清蛋白抗氧化肽的活性，濃度為5 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除率達(dá)到84.07%，濃度為0.5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到（92.63±1.83）%、ABTS+自由基清除率達(dá)到（74.37±1.5）%、Fe2+螯合率達(dá)到89.65%。結(jié)果表明，核桃清蛋白抗氧化肽的抗氧化能力在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系。根據(jù)其劑量關(guān)系趨勢(shì)，我們可以斷定，在濃度足夠大時(shí)，核桃清蛋白抗氧化肽對(duì)羥基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基的清除率及Fe2+螯合率均能夠達(dá)到100%。而且通過與其他原料的蛋白、多肽在不同抗氧化指標(biāo)的比較可以知道，清蛋白抗氧化肽的抗氧化指標(biāo)效果是非常好的。所以核桃清蛋白抗氧化肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，對(duì)幾種自由基均有顯著的清除作用，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有廣闊的研究?jī)r(jià)值和市場(chǎng)前景。

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Preparation and Activity of Antioxidant Peptide from Walnut Albumin

LIU Wei1，2，MIN Wei-hong1，2，*，LIU Chun-lei1，2，CAO Bai-ying1，2，ZHAO Fan-rui1，2
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；
2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

Walnut albumin were used as raw material，walnut albumin isolated was hydrolyzed by Alcalase to prepare antioxidant peptide.Through single-factor experiment and response surface method，the optimal hydrolysis conditions were determined as pH of 9.5，temperature of 45℃，substrate concentration of 4%，Alcalase concentration of 8 000 U/g and hydrolysis time of 2.5 h.To assess the antioxidant potential，walnut albumin antioxidant peptide was tested for its ferrous ions chelating capacity and scavenging capacities against hydroxyl radical，DPPH·，ABTS+·.The experimental results showed that walnut albumin antioxidant peptide had significant scavenging effect against several kinds of free radicals，and ferrous ions chelating capacity，and it was a kind of natural antioxidants which had stronger antioxidant activities.

walnut albumin；hydrolysis optimization；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.010

2016-12-15

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102206）

劉威（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：食品生物化學(xué)與功能性食品。

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程、糧油科學(xué)與深加工技術(shù)研究。