姚秋萍，衛(wèi)亞麗，楊瓊，盧慶祝

（貴州民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

油菜花粉多糖羧甲基化分子修飾及其抗氧化研究

姚秋萍，衛(wèi)亞麗，楊瓊，盧慶祝

（貴州民族大學(xué)化學(xué)與生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

以油菜花粉多糖為原料，采用氫氧化鈉-氯乙酸法，分別在0.5 mol/L和2.0 mol/L NaOH濃度條件下對油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP）進(jìn)行羧甲基化修飾，并對其清除羥自由基（·OH）、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明：羧甲基與油菜花粉多糖形成羧甲基化合物，得到取代度分別為0.47和0.55的2個(gè)改性產(chǎn)物，羧甲基油菜花粉多糖1（Carboxymethylated rape pollen polysaccharide1，CM-RPP1）和羧甲基油菜花粉多糖2（Carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2，CM-RPP）2，RPP、CM-RPP1和CM-RPP2表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性，總的自由基清除能力大小為CM-RPP2＞CM-RPP1＞RPP。與未修飾油菜花粉多糖相比，羧甲基化修飾能提高油菜花粉多糖的體外抗氧化活性。

油菜花粉多糖；羧甲基化修飾；抗氧化活性

由物理因素、化學(xué)反應(yīng)和代謝過程產(chǎn)生的自由基給機(jī)體帶來很多病理性的影響，如引起DNA損傷、致癌作用、和衰老有關(guān)的細(xì)胞變性[1]。油菜多糖是油菜花粉的主要有效成分之一。藥理研究表明，油菜花粉多糖具有增強(qiáng)免疫功能[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]等作用。

多糖羧甲基化即指向多糖大分子鏈上引入羧甲基基團(tuán)，多糖羧甲基化能增大多糖的溶解度和電負(fù)性，可以提高多糖的水溶性，修飾后多糖有可能具有較修飾前更高的活性或者產(chǎn)生新的活性[5-9]。杏鮑菇多糖[10]、金銀花多糖[11]、雞腿菇多糖[12]、當(dāng)歸多糖[13]、黑木耳多糖[14]、靈芝多糖[15]經(jīng)羧甲基化后抗氧化性能明顯提高，羧甲基紅棗多糖[16]可增強(qiáng)對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，羧甲基茯苓多糖[17]可以抑制乙肝病毒。目前對油菜花粉多糖的研究主要集中在提取、分離純化本研究對油菜花粉多糖進(jìn)行羧甲基化分子修飾等方面的研究，而對油菜花粉多糖的羧甲基化結(jié)構(gòu)修飾的研究未見報(bào)道，并對其修飾前后的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為油菜花粉的開發(fā)利用以及新型保健品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜花粉多糖（rape pollen polysaccharides，RPP），貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院藥物與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，純度為74.86%；透析袋（MD34型，截留分子量 8 000 Da～14 000 Da，進(jìn)口分裝）；乙酸、單氯乙酸、DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、NaOH、濃 HCl、無水乙醇、95%乙醇、抗壞血酸、鄰苯三酚、三（羥甲基）氨基甲烷、FeSO4、水楊酸、H2O2等均為分析純。

1.2 主要儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；756PC紫外可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；傅里葉Nicolct6700型紅外光譜儀：上海萊?？茖W(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 油菜花粉多糖的羧甲基化分子修飾

采用氫氧化鈉-氯乙酸反應(yīng)體系[18]。準(zhǔn)確稱取1 g油菜花粉多糖，分別溶于不同濃度（0.5、2.0 mol/L）的NaOH溶液中，劇烈攪拌下緩慢加入6 g的單氯乙酸，混合均勻后在60℃條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h，冷卻，用冰乙酸（或NaOH溶液）中和溶液的pH值為7.0，過濾，濾液透析72 h，冷凍干燥得到羧甲基化油菜花粉多糖[Carboxymethylated rape pollen polysaccharide1（CMRPP1），Carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2（CM-RPP2）]。

2.2 羧甲基化油菜花粉多糖取代度（DSCM）的測定

采用酸堿滴定法[19]。精確稱量10 mg羧甲基化油菜花粉多糖樣品，于100℃干燥1 h后轉(zhuǎn)入錐形瓶中，加入3 mL 70%乙醇，混勻后放置5 min。再依次加入10 mL的H2O，50 mL 0.5 mol/L的NaOH溶液?；旌虾髷嚢柚敝翗悠啡芙?。然后用濃度為0.1mol/L鹽酸滴定，酚酞作為指示劑，計(jì)算每克羧甲基化油菜花粉多糖所需鹽酸的毫摩爾數(shù)（A）：

其中：V0代表加入的NaOH的體積，mL；V2代表測定消耗的HCl的體積，mL；V1代表空白測定所消耗的鹽酸的體積；M0代表加入的NaOH的濃度；M代表HCl的濃度；W為樣品的質(zhì)量，g。

羧甲基取代度（DS）計(jì)算公式如下：

2.3 紅外光譜分析

采用KBr壓片法，分別測定RPP、CM-RPP1、CMRPP2的紅外光譜。波數(shù)范圍為4 000 cm-1～400 cm-1，儀器分辨率為0.5 cm-1，靈敏度為90，掃描次數(shù)為32/64。

圖1 RPP的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of RPP

圖2 CM-RPP1紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of CM-RPP1

圖3 CM-RPP2紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of CM-RPP2

2.4 羧甲基化油菜花粉多糖對羥基自由基（·OH）的清除率

利用Fenton反應(yīng)來引發(fā)產(chǎn)生羥基自由基[20]。在試管中依次加入1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液、6 mmol/L FeSO4溶液，然后分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，最后加入6 mmol/L的H2O2溶液1mL啟動(dòng)反應(yīng)，靜置30 min后于波長510 nm處測定其吸光度。以蒸餾水代替羧甲基化油菜花粉多糖溶液做空白對照，VC水溶液做陽性對照，對·OH清除率按下式計(jì)算：

式中：A0為空白吸光度；AX為樣品吸光度。

2.5 羧甲基化油菜花粉多糖對超氧陰離子自由基的清除率

利用鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)引發(fā)產(chǎn)生超氧陰離子自由基[21]。在試管中依次加入濃度為50 mmol/L，pH8.2的Tris-HCl（即三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液）緩沖液4 mL，然后分別加入1 mL不同質(zhì)量濃度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，混勻后于25℃的水浴鍋中放置10 min，加入預(yù)熱至25℃的鄰苯三酚（60 mmol/L）溶液0.1 mL，反應(yīng)5 min后滴加2滴10 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，并于波長325 nm處測定其吸光度A1，同法測定用蒸餾水代替鄰苯三酚后的吸光度A2，以及用1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液后測得的吸光度A0。VC水溶液做陽性對照，對的清除率按下式計(jì)算：

2.6 羧甲基化油菜花粉多糖對DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除率

利用在波長517 nm處DPPH無水乙醇溶液紫色團(tuán)的特定吸收峰原理來測定DPPH自由基的清除率[22]。在具塞試管中加入0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 mL，再分別加入2 mL不同質(zhì)量濃度的羧甲基化油菜花粉多糖水溶液，混均，室溫下靜置30 min后，于波長517 nm處測吸光度AI，同時(shí)測定2 mL 0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液與2 mL 50%乙醇混合液的吸光度A0以及2 m不同質(zhì)量濃度的羧甲基化菜花粉多糖溶液與50%乙醇混合后的溶液測定吸光度AJ。VC水溶液做陽性對照，DPPH自由基的清除率按下式計(jì)算：

3 結(jié)果與分析

3.1 羧甲基化油菜花粉多糖的取代度

采用堿性-氯乙酸反應(yīng)體系對油菜花粉多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，由公式計(jì)算出CM-RPP1、CM-RPP2的取代度分別為0.47、0.55。

3.2 紅外光譜圖分析

RPP、CM-RPP1和CM-RPP2的紅外光譜圖分別見圖1、圖2和圖3。油菜花粉多糖的羧甲基化修飾產(chǎn)物仍具有多糖的特征紅外吸收峰：3 400 cm-1附近處O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰、2 935 cm-1附近處C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 240 cm-1附近處C-H變角振動(dòng)吸收、1 039cm-1附近處的C-O-H平面彎曲振動(dòng)吸收外；與圖1比較，圖2和3在1654.89 cm-1是羧基（-COOH）的C=O非對稱振動(dòng)吸收峰、1 412 cm-1處與羧基相連的甲基（-CH3）的C-H變角振動(dòng)吸收、1 326 cm-1處C=O的對稱伸縮吸收增強(qiáng)，并且隨著羧甲基取代度的增加吸收增強(qiáng)，充分表明了羧甲基化油菜花粉多糖中羧甲基（-OCH2-COOH）的存在。從譜圖上可以看出，羧甲基化后油菜花粉多糖的羥基峰（3 400 cm-1）的強(qiáng)度僅稍有減小，說明油菜花粉多糖僅有部分羥基被羧甲基化且取代度較低。

3.3 對羥基自由基的清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對羥基自由基的清除作用見圖4。

圖4 對羥基自由基的清除作用Fig.4 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on hydroxyl free radicals

由圖4可知，隨著多糖濃度的增加，CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用逐漸增強(qiáng)。相比較而言，CM-RPP2表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除活性，但是清除能力均低于相同質(zhì)量濃度的VC。

3.4 對超氧陰離子自由基清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對超氧陰離子自由基的清除作用見圖5。

圖5 對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on superoxide anion free radicals

由圖 5 可知，CM-RPP1、CM-RPP2和 RPP 對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基均表現(xiàn)出了一定的清除能力。當(dāng)多糖濃度在0.2 mg/mL～1 mg/mL時(shí)，隨濃度增加，CM-RPP1、CM-RPP2和 RPP 對超氧陰離子自由基清除率提高較快；當(dāng)多糖濃度大于1 mg/mL時(shí)，CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對超氧陰離子自由基清除作用平緩。

3.5 對DPPH自由基清除作用

CM-RPP1、CM-RPP2和RPP對DPPH自由基的清除作用見圖6。

圖6 對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging capacity of RPP，CM-RPP1and CM-RPP2on DPPH free radicals

由圖6可知，當(dāng)多糖濃度在0.2 mg/mL～0.8 mg/mL時(shí)，CM-RPP1、CM-RPP2對 DPPH 的清除作用相當(dāng)，而多糖濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，CM-RPP2對DPPH的清除作用明顯大于CM-RPP1，但是均大于RPP對DPPH的清除作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以油菜花粉多糖為研究對象，經(jīng)羧甲基化修飾后得到CM-RPP1、CM-RPP22個(gè)修飾產(chǎn)物，取代度分別為0.47、0.55。紅外光譜圖譜說明羧甲基化油菜花粉多糖中羧甲基（-OCH2-COOH）的存在。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，油菜花粉多糖經(jīng)羧甲基化修飾后對DPPH自由基、·OH和均具有較好的清除能力，并且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。在相同濃度條件下，CMRPP1、CM-RPP2的清除能力均高于RPP，說明油菜花粉多糖經(jīng)羧甲基化修飾后，抗氧化作用明顯增強(qiáng)，特別是CM-RPP2表現(xiàn)出了更好的抗氧化活性?？赡苁怯捎谟筒嘶ǚ鄱嗵墙?jīng)過羧甲基分子修飾后，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使其抗氧化活性提高。關(guān)于羧甲基化油菜花粉多糖的構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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Carboxymethylated Modification and Antioxidant Activity of Rape Pollen Polysaccharides

YAO Qiu-ping，WEI Ya-li，YANG Qiong，LU Qing-zhu
（School of Chemistry and Eco-Environmental Engineering，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

Polysaccharides from rape pollen （RPP）was carboxymethylated by alkaline chloroacetic acid at 0.5 mol/L and 2.0 mol/L NaOH respectively to obtain carboxymethylated rape pollen polysaccharides（CM-RPP）.The scavenging capacities of hydroxyl free radicals，superoxide anion radical，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl were assayed，with vitamin C （VC）as control.The results were that two carboxymethylated polysaccharides of RPP with degree of substitution （SD）of 0.47 and 0.55，named carboxymethylated rape pollen polysaccharide1（CM-RPP1）and carboxymethylated rape pollen polysaccharide 2（CM-RPP2），were obtained.RPP，CM-RPP1and CM-RPP2had certain scavenging ability to OH·free radical，·free radical and DPPH free radical.Total antioxidant activity was CM-RPP2＞CM-RPP1＞RPP.Compared with RPP，the antioxidant activity of polysaccharides in rape pollen can be improved through carboxymethylation.

polysaccharides of rape pollen；carboxymethylation modification；antioxidative activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.007

2017-06-01

貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合字[2015]7210）

姚秋萍（1978—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品化學(xué)，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。